實驗性大鼠缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡時序性表達(dá)研究

劉曉杰，王東明

（吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011）

0 引言

短暫性局灶性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡機制復(fù)雜，但這種損傷背后的細(xì)胞死亡式還沒有得到很好的描述。至少有兩種細(xì)胞死亡形式：壞死和凋亡參與了這一過程，盡管也有人認(rèn)為缺血性神經(jīng)元死亡是通過一種新的途徑發(fā)生的，該途徑具有壞死和凋亡的某些特征[1]。這一爭議可能部分是由于用于研究缺血性腦損傷的方法不同所致。腦缺血后的炎癥反應(yīng)包括外周血白細(xì)胞從循環(huán)到腦內(nèi)的浸潤以及促炎細(xì)胞因子的上調(diào)。細(xì)胞因子IL-1b、TNFa 和IL-6 的表達(dá)高峰在局灶性缺血后12～24h。最近的證據(jù)表明，這些細(xì)胞因子中的每一種都可能導(dǎo)致中風(fēng)后神經(jīng)元損傷的加劇。卒中患者外周循環(huán)中IL-6 水平升高與卒中嚴(yán)重程度、患者的功能恢復(fù)有關(guān)[2]。在動物模型中，多形核白細(xì)胞在局灶性缺血后6-12h 內(nèi)與腦毛細(xì)血管黏附，隨后白細(xì)胞向腦組織遷移，最近在小鼠缺血模型中觀察到這一現(xiàn)象。我們應(yīng)用多種定量和定性技術(shù)，探討大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷模式[3]。

1 隨時間變化細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測腦細(xì)胞核DNA 裂解及凋亡小體形成情況，細(xì)胞凋亡特征為二倍體核樣峰(AP 峰)。根據(jù)AP 峰所占比例，可對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量分析。

局灶性腦缺血區(qū)細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞壞死結(jié)構(gòu)改變。細(xì)胞凋亡與壞死并存。通過光鏡和電鏡的病理形態(tài)學(xué)觀察，可以很好地區(qū)分凋亡和壞死。但核心區(qū)和半影區(qū)的分布明顯不同。大體上，局灶性腦缺血所致的腦損傷由嚴(yán)重梗死核心區(qū)和低灌注外周區(qū)組成[4,5]。隨著缺血時間的延長，缺血核心區(qū)腦組織發(fā)生壞死，而缺血環(huán)境相對較輕。因此，如果及時采取治療措施，可能會挽救缺血腦組織的周圍環(huán)境。否則，這些外圍區(qū)域可能會形成新的壞死區(qū)[6]。近年來，隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，有學(xué)者[7]認(rèn)為無論是腦缺血后的腦組織損傷還是缺血后的再灌注損傷都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

最近有研究采用健康雄性成年昆明小鼠70 只，六七周齡，體質(zhì)量20～22 g，將大鼠分為對照組和缺血再灌注組，再分為假手術(shù)組建立了大鼠局灶性腦缺血(MCAO)再灌注模型。通過大腦近端外動脈插入細(xì)絲，阻斷大腦中動脈的起始部。抽出細(xì)絲，再次建立循環(huán)。短暫阻斷2 血流小時。流式細(xì)胞儀(FCM）檢測海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率[8]，隨著缺血再灌注時間的延長，缺血中心區(qū)和半影區(qū)腦細(xì)胞DNA 裂解百分率均明顯增加。缺血2 小時再灌注24 小時后，缺血核心區(qū)和半影區(qū)DNA 裂解百分率均明顯升高，缺血再灌注24 小時后缺血區(qū)DNA 裂解百分率明顯高于2 小時(P＜0.01)，糖尿病組缺血再灌注24 小時再灌注24 小時后缺血區(qū)DNA 裂解百分率較前升高不明顯(P＜0.01)。腦組織有明顯的損傷傾向。提示損再灌注明顯加重缺血半影區(qū)細(xì)胞凋亡，加速缺血核心區(qū)神經(jīng)元壞死由半影區(qū)向中線擴展的過程[9]。

2 隨時間變化細(xì)胞因子水平變化

需要小鼠模型來闡明中風(fēng)時導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的具體機制。幾種細(xì)胞因子已經(jīng)被報道在腦缺血大鼠模型中受到調(diào)節(jié)；最近利用小鼠大腦中動脈阻塞模型的觀察表明，許多細(xì)胞因子和生長因子參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)[10]。雖然目前尚不清楚細(xì)胞因子表達(dá)改變與神經(jīng)元損傷之間是否存在直接聯(lián)系，但最近的幾項研究支持單個、細(xì)胞因子與神經(jīng)學(xué)結(jié)果之間存在很強的相關(guān)性。TGFb1 似乎在缺血中起到神經(jīng)保護(hù)作用，因為在腹腔注射的小鼠中觀察到較小的梗死[11]。此外，TGFb1 可能在缺血半暗帶處上調(diào)。多項研究提示IL-1 的存在可能加重缺血性損傷。IL-1b 和IL-1ra 的早期上調(diào)，此外，我們還顯示在短暫性和永久性缺血后IL-1a 水平有輕微的增加。另外，已有研究表明IL-1ra 過表達(dá)可減輕小鼠缺血性腦損傷，提示IL-1 系統(tǒng)在腦缺血中起重要作用[12]。

有研究顯示了TNFa mRNA 水平的早期明顯的增加，然而，TNFa 在化學(xué)性腦損傷中的作用尚不清楚。雖然在TNFa受體敲除小鼠中的這一發(fā)現(xiàn)暗示了TNFa 的神經(jīng)保護(hù)作用，但應(yīng)該指出的是，在這些小鼠中，IL-1 可能存在代償性增加，這可能會加劇缺血的神經(jīng)元損傷。未損傷的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)未檢測到IL-1b、IL-6 和TNFa。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，這些細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)明顯誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)表明，卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子的表達(dá)可能受到分層調(diào)控[13]。

短暫性腦缺血早期TNFa mRNA 水平升高，隨后IL-1bmRNA 水平升高。腦缺血損傷的早期細(xì)胞反應(yīng)可能涉及損傷部位的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放多種細(xì)胞毒素，如一氧化氮、興奮性氨基酸和炎性細(xì)胞因子IL-1b、TNFa 和IL-6，腦局灶性缺血引起的急性炎癥的特點是循環(huán)中多形核白細(xì)胞的浸潤。最近一項研究，用RT-PCR 分析永相對E-選擇素mRNA 水平。選擇素mRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)增強。對缺血再灌注小鼠缺血半球的RTPCR 分析顯示的表達(dá)明顯增加。E-選擇素mRNA 的水平達(dá)到峰值為10h。流式細(xì)胞儀檢測腦細(xì)胞核DNA 裂解及凋亡小體形成情況，細(xì)胞凋亡特征為二倍體核樣峰(AP 峰)。根據(jù)AP 峰所占比例，可對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量分析。TNFa 在4h 開始升高，隨后IL-6 在10h～18h 升高，TGFb1 水平后期升高，這可能是由于半影區(qū)神經(jīng)元修復(fù)過程的激活，半影區(qū)是一個神經(jīng)元存活時間更長的區(qū)域，這與該生長因子所具有的神經(jīng)保護(hù)作用相一致。這些細(xì)胞因子在18h，細(xì)胞因子水平達(dá)到峰值[14]。

3 局灶性腦缺血再灌注后不同時間的病理改變

光鏡下可見神經(jīng)元固縮、偏曲，核梭形神經(jīng)元和少量深染神經(jīng)元。缺血2 小時恢復(fù)血流量時，病變范圍隨再灌注時間延長而擴大，再灌注24 小時達(dá)高峰?？梢姶罅可钊镜纳窠?jīng)元細(xì)胞核固縮、偏斜。細(xì)胞質(zhì)具有較強的嗜酸性?；坠?jié)區(qū)可見軸突腫脹、變性。另一方面，出現(xiàn)神經(jīng)元壞死和基質(zhì)腫脹。永久性24 小時缺血組核心大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，壞死區(qū)出現(xiàn)大量膠質(zhì)細(xì)胞增生[15]。半影區(qū)出現(xiàn)固縮，胞核深染，胞漿呈嗜酸性。在相同條件下，糖尿病組腦組織核心壞死范圍和半暗帶范圍明顯大于非糖尿病組。電鏡下，缺血2h，染色質(zhì)開始聚集、變塊狀，分布于核膜周圍，核質(zhì)變得不均勻、固縮。缺血2h 再灌注6～12h 后，上述改變明顯加重。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增生，傾向于沿細(xì)胞核呈同心平行的鞭毛排列，核周水腫明顯。再灌注24 小時后，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴排列紊亂，形成空泡。更嚴(yán)重的是細(xì)胞膜溶解，核膜不完整，核基質(zhì)消失。結(jié)果表明，不僅存在生物多樣性的特征性變化，而且還存在一定的生物多樣性[16]。

4 結(jié)論

腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生伴有細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。小鼠腦缺血時細(xì)胞因子mRNA 的時間變化，細(xì)胞凋亡主要分布在密集缺血灶周圍的缺血半暗帶(IP 區(qū))。缺血核心以細(xì)胞壞死為特征。