尿液代謝組學(xué)的應(yīng)用研究

田智，劉銳，盧夢月，劉付昌盛

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000)

0 引言

代謝組學(xué)是繼蛋白組、基因組等技術(shù)之后開發(fā)的一門新興技術(shù)，通過對差異代謝物及所涉及的代謝通路分析疾病治療過程中的相關(guān)機(jī)制[1]。其目的主要是利用核磁共振(NMR)[2]、液相與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[3]、氣相與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[4]等代謝分析平臺(tái)，分析差異性代謝產(chǎn)物，根據(jù)標(biāo)志物及代謝通路利用數(shù)據(jù)庫分析疾病等變化[5]。目前，代謝組學(xué)已成為新的研究工具[6]。生物體液是代謝組學(xué)研究的主要樣本來源之一，在生物體液中包括血液、痰液、尿液等，因尿液最易收集所以最為常用[7]。傳統(tǒng)的使用血液的實(shí)驗(yàn)室測試仍然是最常見的診斷手段，但這種方法是侵入性的通?；颊咭缽男圆睢Ｒ虼?，必須開發(fā)使用更方便的樣本的準(zhǔn)確和具體的測試。尿液收集是無創(chuàng)的，不需要病人準(zhǔn)備或消耗，這大大提高了依從性。因此在代謝組學(xué)分析中，特別是在臨床實(shí)踐[8]中是首選的。代謝組學(xué)方法在[9]的許多臨床領(lǐng)域有助于診斷和治療學(xué)的發(fā)展。液相色譜(LC)與質(zhì)譜(MS)或核磁共振(NMR)檢測相結(jié)合，是尿液代謝組學(xué)[10]中一種很有前途的微分離平臺(tái)。

1 代謝組學(xué)研究方法

完整的代謝組學(xué)研究方法在分析前需進(jìn)行樣本收集，在收集樣本的選擇上生物樣品的來源主要有生物體液、組織及細(xì)胞，沉淀蛋白、固相萃取法等是生物體液的主要預(yù)處理方法，而組織、細(xì)胞可利用超聲破碎技術(shù)提取[11]，收集樣本后保存在-80℃冰箱。在分析前將樣本在冰上解凍后，在儀器上進(jìn)行分析，通過主成分分析和偏最小二乘判別法分析法等建立模型，并對模型進(jìn)行驗(yàn)證，最后篩選出差異性代謝物。結(jié)合HMDB(Human Metabolome Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)庫，并找出差異性標(biāo)記物所相關(guān)的代謝通路，并其進(jìn)行分析。

2 尿液取樣方法

尿液是代謝組學(xué)中最常見的標(biāo)本[12]。并且較其他樣本更易于收集，在代謝物的定量、定性和數(shù)據(jù)分析中可以連續(xù)重復(fù)取樣[13]。尿液作為人體的排泄物，尿液中的代謝物可能與疾病的發(fā)生發(fā)展、藥物的代謝變化密切相關(guān)。正因?yàn)槿绱?，有研究者做出了相?dāng)大的努力來研究尿代謝組學(xué)作為診斷工具[14]。尿液的樣品前處理相較于血液等較簡單，因?yàn)樗狈?fù)雜性和較低的蛋白質(zhì)含量，從而使它特別適合代謝組學(xué)[15]。但目前仍需要大量的發(fā)展工作來完善尿代謝組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化，并驗(yàn)證早期的報(bào)告。有必要闡明其他疾病的診斷概況和縱向分析，以評估治療和評估預(yù)后。

3 尿液代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)庫

代謝組學(xué)是一個(gè)新興的“組學(xué)”研究領(lǐng)域，該代謝體可以被定義為在一個(gè)特定的細(xì)胞、器官或有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的所有小分子代謝物的完整補(bǔ)體[16]。它與基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組非常相似。由于人類基因組項(xiàng)目，大部分的人類基因組，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組現(xiàn)在已經(jīng)已知，數(shù)據(jù)可以通過電子方式獲得。但是，人類的新陳代謝體還不明確。為了糾正這種情況，人類代謝項(xiàng)目(HMP)于2004年啟動(dòng)，這是識(shí)別和量化人體體內(nèi)所有可檢測的代謝物的一部分。除了實(shí)驗(yàn)識(shí)別和量化不同體液中數(shù)百種代謝物，這個(gè)多年項(xiàng)目的正式任務(wù)是為了確認(rèn)所有以前識(shí)別的代謝物的信息，并提供這些信息作為一個(gè)稱為人類代謝數(shù)據(jù)庫(HMDB)的免費(fèi)電子數(shù)據(jù)庫。研究人員使用核磁共振(NMR)光譜、質(zhì)譜(MS)、化學(xué)結(jié)構(gòu)或化學(xué)公式搜索的數(shù)據(jù)庫[17]。并需要尋找代謝物的濃度、性質(zhì)、位置或代謝物-疾病關(guān)聯(lián)。因此，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫不僅需要關(guān)于化合物和反應(yīng)的信息，而且需要關(guān)于化合物濃度、生物流體或組織位置、物理性質(zhì)和已知疾病關(guān)聯(lián)等數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)需要隨時(shí)獲得，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，充分引用，容易搜索、解釋，它們需要盡可能多地覆蓋人類的新陳代謝體開發(fā)了HMDB數(shù)據(jù)庫。

4 尿液代謝組學(xué)在疾病中的應(yīng)用

尿液代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于各種疾病的研究，代謝組學(xué)可以幫助識(shí)別疾病生物標(biāo)志物，提高對疾病發(fā)病機(jī)制和藥物效應(yīng)的認(rèn)識(shí)[18-19]。代謝組學(xué)是一個(gè)快速擴(kuò)展的領(lǐng)域，可以描述細(xì)胞的代謝途徑，它提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具來評估一個(gè)人的生理狀態(tài)，它產(chǎn)生了比簡單的基因表達(dá)[20]更接近表型的細(xì)胞活動(dòng)快照，從而為確定疾病進(jìn)展的新生物標(biāo)志物和進(jìn)一步闡明疾病發(fā)展的潛在病理生理機(jī)制提供了寶貴的資源，最重要的是，它可能揭示新的治療靶點(diǎn)，以獲得新的洞察藥物作用機(jī)制。有研究者采用代謝組學(xué)技術(shù)研究慢性萎縮性胃炎大鼠尿中的內(nèi)源性差異代謝物，發(fā)現(xiàn)有68種差異代謝物，25種表達(dá)上調(diào)，43種表達(dá)下調(diào)[21]。主要代謝途徑為D谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，組氨酸代謝和嘌呤代謝。段曉璐等[22]利用核磁共振技術(shù)研究腎結(jié)石患者和健康對照組對比差異性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩組共15種代謝物的濃度明顯不同，4種代謝途徑，發(fā)現(xiàn)乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))與腎結(jié)石密切相關(guān)。有研究[23]表明腎損傷是使用順鉑的主要副作用之一，代謝組學(xué)分析可以允許識(shí)別順鉑的腎毒性機(jī)制和識(shí)別順鉑誘導(dǎo)的損傷的生物標(biāo)記物，代謝組學(xué)分析表明，37和35內(nèi)源性代謝物水平分別在大鼠尿液和腎臟中發(fā)生變化，破壞了7條關(guān)鍵代謝途徑，包括三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))、苯丙氨酸代謝、?；撬岷偷突撬岽x和煙酸和煙酰胺代謝等代謝通路。吳桂霞等[24]研究丹紅注射液治療高血壓大鼠的尿液代謝物的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液在改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)代謝物的排泄等方面發(fā)揮作用。邵曉妮等[25]發(fā)現(xiàn)慢性高尿酸血癥性腎病大鼠腎臟和尿液共有26中相同的差異代謝物，其中葡萄糖、天冬氨酸、谷氨酰胺和甲基腺嘌等可能為潛在標(biāo)記物，肯與腎功能的損傷密切相關(guān)。

5 尿液代謝組學(xué)對中醫(yī)證型的研究

隨著尿液代謝組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)可對中醫(yī)的證型研究提供有效研究手段，為中醫(yī)證型提供客觀依據(jù)。楊夢等[26]應(yīng)用采用代謝組學(xué)(UPLC-Q/TOF-MS)技術(shù)，對比正常組和心氣陰虛證心衰大鼠尿液代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)25種潛在生物標(biāo)記物，主要與氨基酸代謝、脂代謝等相關(guān)。李靜等[27]研究冠心病血瘀證大鼠尿液代謝組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證模型主要涉及泛酸和輔酶A生物合成、丙酮酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路。茍小軍等[28]應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究非酒精性肝病肝膽濕熱患者尿液代謝物特征，發(fā)現(xiàn)12個(gè)差異代謝產(chǎn)物，與肝膽濕熱證患者密切相關(guān)的通路主要涉及色氨酸代謝、糖酵解或糖異生等代謝通路。

6 尿液代謝組學(xué)在中藥復(fù)方中的應(yīng)用

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)，中藥復(fù)方機(jī)制一直是研究的難點(diǎn)，但代謝組學(xué)可以為中藥復(fù)方治療后機(jī)體代謝變化提研究供方法，在整體上尋找中藥復(fù)方代謝后的差異性代謝產(chǎn)物及所涉及的相關(guān)通路，從中分析出中藥復(fù)方的治療特點(diǎn)和優(yōu)勢。左健等[29]利用尿液代謝組學(xué)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究證明清絡(luò)飲可以改善關(guān)節(jié)炎大鼠的脂肪酸、氨基酸和能量代謝。劉志剛等[30]通過代謝組學(xué)研究六味補(bǔ)氣膠囊治療治療COPD穩(wěn)定期肺氣虛證患者，分析治療前后血漿和尿液，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)血漿中的十六烷酸、組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等含量趨勢發(fā)生變化，尿液的代謝物比治療前有改變，各代謝物趨勢向健康組的代謝物趨勢發(fā)展。劉婷等[31]研究口服葛根芩連湯后大鼠的尿液、血液和糞便等代謝產(chǎn)物，分析發(fā)現(xiàn)代謝途徑包括甲基化、脫甲基化和葡萄糖醛酸共合等，進(jìn)一步了解葛根芩連湯的吸收和代謝，為臨床藥理研究提供客觀依據(jù)。王鑫等[32]建立了一種基于超高效液相色譜結(jié)合Q-Exactive四極靜電場軌道質(zhì)譜(UPLCQ-ExactiveOrbitrap-MS)的尿液代謝組學(xué)方法，觀察糖尿病視網(wǎng)膜病大鼠的代謝變化，研究補(bǔ)腎活血方對糖尿病腎病的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了9種與糖尿病腎病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)這些生物標(biāo)志物主要與脂質(zhì)代謝、色氨酸代謝和腸道微生物代謝有關(guān)。金一寶等[33]通過代謝組學(xué)技術(shù)研究辛伐他汀對不同性別小鼠尿液代謝的影響，發(fā)現(xiàn)6個(gè)主要差異代謝物，與體內(nèi)脂類代謝有關(guān)，雌鼠和雄鼠表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。

7 思考與展望

代謝組學(xué)技術(shù)在世界生命科學(xué)及生信領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，尿液代謝組學(xué)只運(yùn)用最終的代謝產(chǎn)物，可免除繁雜的生物反應(yīng)，但還需不斷完善，如實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴，樣本收集要求高，推廣普及較難。

尿液代謝組學(xué)在多種疾病診療中已有較多創(chuàng)新的成果，體現(xiàn)了其在疾病診療及中醫(yī)藥研究證型、方藥等方面的突出優(yōu)勢，有可能是解決中醫(yī)藥系統(tǒng)機(jī)制的關(guān)鍵方法，通過對技術(shù)的不斷改良，數(shù)據(jù)庫的不斷完善，加強(qiáng)國際間的合作，為中醫(yī)藥的長遠(yuǎn)發(fā)展提供現(xiàn)代模式。

8 利益沖突

本文作者聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。