轉(zhuǎn)錄組—代謝組聯(lián)合分析揭示低溫下采后雷竹筍木質(zhì)化分子調(diào)控機(jī)制

侯 丹 林新春

(浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

竹筍作為一種天然蔬菜，富含各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性化合物，如膳食纖維、抗氧化物、氨基酸和維生素等，深受人們喜愛。雷竹是中國(guó)特有的栽培竹種，其出筍早、產(chǎn)量高，產(chǎn)量可達(dá)1 500～2 000 kg/667 m2，價(jià)格可達(dá)20 元/kg 左右，收益可達(dá)3 萬(wàn)～7 萬(wàn)元/667 m2，是經(jīng)濟(jì)效益最高的竹種。然而，以雷竹為代表的筍用竹產(chǎn)地主要集中在山區(qū)，且采收期多集中于高溫高濕之際，使得竹筍采后由于消耗體內(nèi)大量水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而迅速老化(木質(zhì)化) 褐變，在常溫下2～3 d 內(nèi)即失去商品價(jià)值和食用價(jià)值，降低經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何有效保鮮是雷竹筍采后貯藏和運(yùn)輸過(guò)程面臨的重要問(wèn)題。

竹筍老化過(guò)程即木質(zhì)化過(guò)程，該過(guò)程與苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、過(guò)氧化物酶(POD) 等酶活性密切相關(guān)。低溫是最主要的竹筍采后保鮮措施，其主要通過(guò)抑制上述關(guān)鍵酶的活性來(lái)降低采后竹筍的木質(zhì)化、纖維化以延緩其衰老。此外，植物激素，例如赤霉素(GA3)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯抑制劑(1-MCP) 等也可延緩PAL、CAD、POD 等酶活性來(lái)延遲竹筍采后保鮮時(shí)間。然而，目前竹筍低溫貯藏研究大部分停留在表型和生理指標(biāo)檢測(cè)方面，關(guān)于其分子調(diào)控機(jī)制知之甚少。特別是關(guān)于木質(zhì)化和低溫通路、植物激素通路的內(nèi)在關(guān)聯(lián)尚不清楚。因此我們針對(duì)上述問(wèn)題展開研究，力圖揭示究竟哪些因素影響了雷竹筍采后老化? 為什么低溫可以有效延長(zhǎng)雷竹筍的采后保鮮時(shí)間? 植物激素是否參與了該過(guò)程調(diào)節(jié)? 哪些基因發(fā)揮了重要作用?

綜上所述，以雷竹筍為材料，利用不同溫度處理明確低溫對(duì)竹筍保鮮的重要作用，通過(guò)“轉(zhuǎn)錄組—代謝組”聯(lián)合分析，揭示低溫下采后雷竹筍中主要的次生代謝物質(zhì)和關(guān)鍵基因，提出了“低溫—茉莉酸—木質(zhì)化”的潛在調(diào)控通路，該結(jié)論不僅在一定程度上豐富了竹筍保鮮現(xiàn)有研究，還為茉莉酸在竹筍采后貯藏、冷鏈運(yùn)輸中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雷竹筍主要采自于浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)(30°15′ N，119°43′ E)，從基部將筍切開，收集后快速將其帶回實(shí)驗(yàn)室，分別測(cè)量樣品長(zhǎng)度和質(zhì)量，選取高度 (20.12±2.87)cm、質(zhì)量(140.48±16.99) g 的鮮筍進(jìn)行常溫和低溫處理，不同處理設(shè)置4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 顆筍，分別在處理0、2、4、6、14 和20 d 后采樣，樣品保存于－80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 表型觀察和生理指標(biāo)檢測(cè)

觀察不同溫度處理下雷竹筍表皮、切口等變化，測(cè)量質(zhì)量，計(jì)算失水率；根據(jù)說(shuō)明書，利用紫外分光光度計(jì)分別在290 和470 nm 下測(cè)定PAL和POD 酶活；同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)在280 nm下測(cè)定總木質(zhì)素含量。

1.3 轉(zhuǎn)錄組和代謝組測(cè)序

提取樣品RNA，質(zhì)檢合格后進(jìn)行cDNA 文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后進(jìn)行功能注釋和通路分析，篩選差異表達(dá)基因；利用LC-MS/MS 技術(shù)，對(duì)采后竹筍中的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定和定量分析，篩選差異代謝物。最后，使用Cytoscape 進(jìn)行代謝物—基因聯(lián)合分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫可顯著延緩采后雷竹筍衰老

在常溫下，采后雷竹筍在4 d 后則嚴(yán)重腐爛變質(zhì)。但在低溫下，采后雷竹筍仍然十分新鮮(原文圖1a)，分別對(duì)失水率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，常溫下樣品在采后第6 d 失水率高達(dá)12%，但低溫下采后第20 d，樣品的失水率僅為8.5% (原文圖1b)。此外，常溫下雷竹樣品的POD 和PAL 酶上升顯著，在第4 d 達(dá)到最大值，但在低溫下，雷竹樣品中POD 和PAL 酶活性上升緩慢，且與CK相比，在前4 d 無(wú)顯著性差異(原文圖1c、d)。綜上所述，低溫貯藏是抑制采后雷竹筍衰老的有效方式。

2.2 植物激素和木質(zhì)素合成通路代謝物在采后雷竹筍中顯著積累

通過(guò)代謝組測(cè)序，共鑒定了145 個(gè)差異代謝物。在本研究中，主要關(guān)注了植物激素通路和木質(zhì)化通路，結(jié)果表明，在植物激素通路中，茉莉酸在低溫貯藏的筍中顯著積累，但脫落酸(ABA)、GA 和乙烯前體物質(zhì)(ACC) 變化不顯著；在木質(zhì)化通路中，木質(zhì)素合成前體物質(zhì)香豆素、4-香豆素酸、反式阿魏酸和L-苯丙氨酸在低溫貯藏20 d 后顯著積累(原文圖2)。本研究進(jìn)一步通過(guò)HPLC 對(duì)上述物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢(shì)與代謝組測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明代謝組數(shù)據(jù)可信。因此認(rèn)為，與常溫相比，低溫可以顯著誘導(dǎo)茉莉酸在采后雷竹筍中的合成，同時(shí)可以明顯延遲木質(zhì)素的生物合成。

2.3 植物激素和木質(zhì)素合成通路相關(guān)基因在采后雷竹筍中差異表達(dá)顯著

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，本研究在CK vs LT-1、CK vs LT-2、CK vs LT-3中分別鑒定了10 349、12 192、和13 987 條差異代謝物質(zhì)，我們重點(diǎn)關(guān)注了茉莉酸合成通路和木質(zhì)素合成通路關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明，大部分茉莉酸合成通路基因在低溫貯藏中的雷竹筍中差異表達(dá)顯著，例如PvJAZ-2、PvJAZ-3、PvJAZ-4、PvJAZ-8、PvJAZ-11和PvJAZ-12顯著上調(diào)。通過(guò)熒光定量PCR 對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些基因在低溫下表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組一致，并且大部分基因的表達(dá)量顯著高于常溫保存樣品，因此低溫可以顯著誘導(dǎo)采后雷竹筍中茉莉酸合成基因的表達(dá)(原文圖3)。此外，本研究通過(guò)共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)茉莉酸合成基因PvLOX5、PvOPR2、PvPEX5和PvJAZ-4與茉莉酸呈顯著正相關(guān)，可能在低溫貯藏雷竹筍中茉莉酸的合成過(guò)程發(fā)揮重要作用(原文圖S8a)。

本研究還對(duì)木質(zhì)素合成通路基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，大部分木質(zhì)素合成基因，例如PvPAL-2/4/6、PvC4H-3/4、PvHCT-2、PvCCR-2/3/4、PvCAD-2/3/4、PvCoMT-2/3在低溫貯藏的雷竹筍中顯著下調(diào)，說(shuō)明木質(zhì)素合成可能被抑制。對(duì)這些基因表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組一致，且大部分低于常溫下雷竹筍中的表達(dá)量，說(shuō)明低溫可以顯著抑制木質(zhì)素合成基因表達(dá)(原文圖4)。通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，共24 條木質(zhì)素合成基因與木質(zhì)素合成前體物質(zhì)顯著相關(guān)，其中PvHCT-9，PvC4H-2/3，PvC3H-1，Pv4CL-5和VND7與香豆素、4-香豆素酸、反式阿魏酸和L-苯丙氨酸這4個(gè)前體物質(zhì)均呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明這些基因在低溫貯藏雷竹筍中木質(zhì)素合成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用(原文圖S8b)。

2.4 “低溫—植物激素—木質(zhì)素合成”通路基因顯著關(guān)聯(lián)

本研究對(duì)低溫通路基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PvCRPK-1/3/4/5、PvWCOR410c、PvICE1-1/2和PvDREB2B/2C在采后雷竹筍中顯著上調(diào)，進(jìn)一步與關(guān)鍵的木質(zhì)素合成基因、茉莉酸合成基因建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，PvCRPK-4/-5、PvICE2-1/2和PvDREB2B為該網(wǎng)絡(luò)中的中心基因，它們分別和10 條以上其他基因相關(guān)聯(lián)，其中負(fù)相關(guān)基因主要包括木質(zhì)素合成通路基因，例如PvNST1/2-1、PvC3H-2/3、PvC4H-2/4、PvCAD-1/2/3/4、PvCCR-2/4、PvHCT-2/5/8、PvPAL-2/4/6；正相關(guān)基因主要為茉莉酸合成基因，包括PvOPR2、PvJAZ-4和PvPEX5。此外，PvOPR2、PvJAZ-4和PvPEX5同樣與一系列木質(zhì)素合成基因，例如PheC3H-2/3、PheCAD-1/2/3/4、PheHCT-2/5/8和PhePAL-6顯著負(fù)相關(guān)(原文圖5)。上述結(jié)果說(shuō)明，低溫通路、茉莉酸通路和木質(zhì)素合成通路基因可能通過(guò)形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同參與采后雷竹筍衰老調(diào)控。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)“轉(zhuǎn)錄組—代謝組”聯(lián)合分析，初步揭示了低溫調(diào)控采后雷竹筍木質(zhì)化的2 條潛在通路:“低溫—木質(zhì)素通路”和“低溫—茉莉酸—木質(zhì)素通路”(原文圖6)，并發(fā)現(xiàn)與常溫相比:1) 低溫可以顯著延緩采后雷竹筍保鮮時(shí)間至少20 d，在此過(guò)程中茉莉酸顯著積累，可能是低溫下延遲竹筍保鮮的重要植物激素；2)

PvOPR2、PvJAZ-4、PvPEX5、PvC3H-2/3、PvC4H-2/4等基因在低溫處理采后雷竹筍中差異表達(dá)顯著，可能是調(diào)控低溫下竹筍保鮮的重要因子。上述結(jié)論為采后竹筍貯藏和保鮮分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，可為今后茉莉酸在采后雷竹筍保鮮應(yīng)用以及利用分子生物學(xué)手段改良竹筍貯藏特性等提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

原文出處

DanHou，Haiwen Lu，Zhongyu Zhao，Jialong Pei，Huqing Yang，Aimin Wu，Xuejun Yu*，Xinchun Lin*.Integrative transcriptomic and metabolomic data provide insights into gene networks associated with lignification in postharvest lei bamboo shoots under low temperature[J].Food Chemistry，2021.https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.130822.