華中枸骨葉總黃酮純化及抗RA滑膜炎癥活性評(píng)價(jià)

陳宇，陽航，路艷霞，周晨溪，閆夢(mèng)瑩，李路軍,2,3，胡澤華

(1.藥物高通量篩選國家與地方聯(lián)合工程研究中心， 中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北大學(xué)， 湖北 武漢 430062；2.甘肅百草中藥材種植有限公司， 甘肅 蘭州 7301024；3.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所， 深圳 518020；4.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)自身免疫性疾病,以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥為主要臨床表現(xiàn)[1]. RA中滑膜組織的改變最為顯著，滑膜成纖維細(xì)胞是關(guān)節(jié)滑膜最活躍的組成細(xì)胞，它在RA的發(fā)病、慢性炎癥的維持、骨與軟骨的破壞等方面具有重要的作用[2]，異常增生的滑膜成纖維樣細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白酶和致炎細(xì)胞因子，促發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)，是導(dǎo)致軟骨和骨質(zhì)破壞的主要因素[3]，因此抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞的增生及炎癥是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要策略.

華中枸骨葉為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)植物華中枸骨(I.centrochinensis)的干燥葉，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕作用，在湖北恩施土家族地區(qū)常用于治療RA，具有豐富的民族民間用藥經(jīng)驗(yàn)[4]. 林立冬等[5]從華中枸骨葉中分離鑒定出柚皮素等多個(gè)黃酮類化合物. 本研究室前期研究證實(shí)其醇提物具有很強(qiáng)的抗炎和自由基清除作用[6]，并先后從中分離得到多個(gè)具有明顯抗炎活性的黃酮類成分[7-11]，提示黃酮類成分可能為其主要抗RA活性物質(zhì). 為深入開發(fā)利用該民族藥物，本研究對(duì)華中枸骨葉總黃酮(ICTF)進(jìn)行富集純化，并以TNF-α誘導(dǎo)的人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞體外評(píng)價(jià)其抗RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥活性，旨在為開發(fā)以ICTF為主的藥品及功能食品提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器華中枸骨葉，2015年6月采自湖北省恩施州建始縣，原植物經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院郜紅利教授鑒定為華中枸骨Ilexcentrochinensis的葉，樣品標(biāo)本(No. IC-20150615)保留在湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室. 人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A由重慶醫(yī)科大學(xué)朱深銀老師饋贈(zèng).

槲皮素對(duì)照品(批號(hào)10081-9905，中國藥品生物制品檢定所)；D101、D101-1、DA201、DS401、DM301大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)；乙醇、甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，各試劑均為分析純)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(澳洲Gibco公司)；雙抗、胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；腫瘤壞死因子TNF-α、二甲基亞砜DMSO和噻唑藍(lán)MTT(Sigma公司)；NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；吲哚美辛腸溶片(山西太原藥業(yè)有限公司)；TRIZOL(Invitrogen生物科技公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒(上海東洋紡生物科技有限公司).

紫外分光光度計(jì)UV-1500 PC型(上海美析儀器有限公司)；SF400 A電子天平(上海晶安生物科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；超凈工作臺(tái)(中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；BIO-RAD iMARKTM酶標(biāo)儀、My CyclerTM Thermal、BIO-RAD CFX ConnectTM Real-Time System(美國BIO-RAD公司)；Imager2000凝膠成像分析儀(美國Alpha-Innotech公司)；水平電泳槽DYY-6C(北京市六一儀器廠).

1.2 華中枸骨總黃酮提取純化

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品0.002 5 g和華中枸骨葉總黃酮適量，溶解后80%乙醇定容于50 mL容量瓶. 分別取槲皮素對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和總黃酮溶液適量，各自置于10 mL容量瓶，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再加入0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入4 mL 4% NaOH溶液，搖勻，用80%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻靜置15 min. 以相應(yīng)試劑作為空白，在波長200～800 nm進(jìn)行波長掃描. 選擇測(cè)定波長. 以A值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)A值計(jì)算樣品中總黃酮的量，并按下式計(jì)算每一步純化后總黃酮含量和轉(zhuǎn)移率. 總黃酮含量=總黃酮量/固形物量；轉(zhuǎn)移率=處理后總黃酮量/處理前總黃酮量.

1.2.2 總黃酮的提取 取華中枸骨葉10.0 kg，適當(dāng)粉碎，80% 的乙醇40 L冷浸提取3次，每次48 h，合并提取液并干燥，得乙醇總提取物862 g. 計(jì)算總提取物中總黃酮含量.

1.2.3 堿溶酸沉法 準(zhǔn)確稱取華中枸骨葉乙醇總提取物干燥粉末5.00 g，用蒸餾水分散，加入適量5% NaOH至pH=8～9，水浴保持12 h，抽濾合并濾液；再用濃鹽酸將濾液調(diào)至pH=3～4，靜置24 h，抽濾，合并沉淀；用水將沉淀物洗至中性，干燥后得總黃酮粗粉，試驗(yàn)平行進(jìn)行3次. 計(jì)算總黃酮含量以及轉(zhuǎn)移率.

1.2.4 石油醚脫脂法 稱取上步總黃酮提取物5.00 g，以蒸餾水充分分散，置于250 mL分液漏斗中，以等量的石油醚萃取3次，棄石油醚層，將水層干燥，得總黃酮干燥粗粉. 3次平行試驗(yàn)后測(cè)定并計(jì)算其總黃酮含量及轉(zhuǎn)移率.

1.2.5 聚酰胺吸附法 取經(jīng)石油醚脫脂所得的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用多量的水分散溶解，聚酰胺柱色譜吸附，分別用30%、50%、95%乙醇溶液洗脫至近無色，收集洗脫液. 試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量以及轉(zhuǎn)移率.

1.2.6 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂的選擇：準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的D101、D101-1、DS401、DA201、DM301大孔吸附樹脂各250 g，裝入色譜柱中(柱體積約300 mL，徑高比為1∶8). 取經(jīng)石油醚脫脂所得的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用蒸餾水充分溶解，大孔吸附樹脂柱色譜反復(fù)吸附，分別用適量30%、50%、95%乙醇洗脫至近無色，收集洗脫液干燥，測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量及轉(zhuǎn)移率. 每種樹脂分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn).

洗脫劑用量考察：準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂250 g，濕法裝柱，取純化得到的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用蒸餾水混懸后，D101樹脂柱色譜吸附，用50%的乙醇進(jìn)行洗脫，按柱保留體積分段收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的量，計(jì)算其收率，以總黃酮收率對(duì)洗脫體積繪制洗脫曲線，考察洗脫劑用量.

1.2.7 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜法 取上步經(jīng)大孔樹脂純化所得的總黃酮干粉0.50 g，用適量水溶解，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20色譜柱，甲醇進(jìn)行洗脫，以1/2柱體積為1個(gè)流分收集并依次進(jìn)行編號(hào)，進(jìn)行鹽酸鎂粉反應(yīng)，待反應(yīng)呈陰性時(shí)停止收集，合并甲醇洗脫液，濃縮后真空干燥得干燥粉末，測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量以及轉(zhuǎn)移率.

1.2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取華中枸骨葉乙醇提取物84 g，以適量蒸餾水充分分散，按照優(yōu)選的純化方法純化華中枸骨葉總黃酮，平行重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定所得總黃酮含量以及總轉(zhuǎn)移率.

1.3 華中枸骨葉總黃酮抗RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥活性

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞MH7A置于含10% 滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3.2 MTT MH7A細(xì)胞懸液以每孔1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入含質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200、400 μg/mL總黃酮的培養(yǎng)基處理24 h，每孔加入200 μL (0.5 mg/mL) MTT孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，于570 nm處測(cè)各孔吸光值.

1.3.3 NO的測(cè)定 MH7A細(xì)胞懸液以每孔1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)空白組、模型組(50 ng/mL TNF-α)、陽性對(duì)照組(0.054 35 μmol/L吲哚美辛)和總黃酮給藥組(低、中、高). 每孔加入50 ng/mL TNF-α和不同濃度的樣品培養(yǎng)基 200 μL，培養(yǎng)24 h，吸取上清液，按照NO測(cè)定試劑盒(Griess法)說明書方法測(cè)定吸光值，并計(jì)算各上清液中NO濃度.

1.3.4 RT-qPCR MH7A細(xì)胞懸液以每孔1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，給藥分組同上，不同濃度給藥預(yù)處理2 h后，加入TNF-α(50 ng/mL) 刺激6 h. TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR采用SYBR Greenl熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行，其他定量PCR條件為預(yù)變性95 ℃、5 min，變性95 ℃、30 s，退火60.6 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40次循環(huán). 目標(biāo)基因IL-1β、IL-6、IL-8及內(nèi)參β-actin引物序列如下：IL-1β：F 5’-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3’，R 5’-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3’；IL-6：F 5’-GAACTCCTTCTCCACAAGCG-3’，R 5’-TTTTCTGCCAGTG CCTCTTT-3’；IL-8：F 5’-AAGAAACCACCGGAAGGAAC-3’，R 5’-ACTCCTTGGCAAAACTGCAC-3’；β-actin：F 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，R 5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’，平行重復(fù)3次.

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析本文中數(shù)據(jù)均表示為平均值(Mean±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD)，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Student’st檢驗(yàn)，P值小于0.05或0.01被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Graph Pad Prism 6.0繪制圖形.

2 結(jié)果與分析

2.1 華中枸骨總黃酮提取純化

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量測(cè)定 槲皮素和樣品的顯色溶液在320 nm處均有最大吸收峰，因此選擇λmax320 nm為測(cè)定波長. 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.046 5C+ 0.020 2，R2=0.999 6，槲皮素在2.5～15 μg/mL質(zhì)量濃度與A值呈良好線性關(guān)系. 按照該方法測(cè)定華中枸骨總提取物中總黃酮含量為5.88%，RSD為0.12%(n=3).

2.1.2 堿溶酸沉法和石油醚脫脂法初步純化結(jié)果 如表1所示，華中枸骨乙醇總提取物經(jīng)堿溶酸沉法處理得到的總黃酮含量為(6.54±0.30)%，轉(zhuǎn)移率(19.98±0.19)%；經(jīng)石油醚脫脂后總黃酮含量升至(11.08±0.83)%，轉(zhuǎn)移率為(85.14±4.92)%，純化效果明顯優(yōu)于堿溶酸沉法. 因此，采用石油醚脫脂法進(jìn)行初步純化，可除去多量的脂溶性色素等雜質(zhì)，以利于后續(xù)進(jìn)一步采用適宜方法純化、富集總黃酮.

表1 堿溶酸沉法和石油醚脫脂法初步純化總黃酮結(jié)果 %

圖1 動(dòng)態(tài)洗脫曲線圖

2.1.3 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法純化結(jié)果如表2所示，石油醚脫脂后粗總黃酮經(jīng)聚酰胺柱色譜吸附后，50%乙醇洗脫總黃酮純度提高至(20.09 ± 1.77) %，總黃酮轉(zhuǎn)移率為(51.85 ± 3.05)%.以總黃酮含量為主要考察因素，結(jié)合考察轉(zhuǎn)移率，比較不同大孔樹脂純化效果，結(jié)果表明，相同醇洗脫溶劑，D101大孔樹脂純化總黃酮含量明顯偏高，采用D101大孔吸附樹脂吸附經(jīng)50%乙醇洗脫純化效果最好，總黃酮含量達(dá)到(31.58 ± 0.94)%，總黃酮轉(zhuǎn)移率為(56.84 ± 1.58)%，純化效果也明顯優(yōu)于聚酰胺吸附法. 進(jìn)一步考查大孔樹脂純化洗脫劑用量，結(jié)果如圖1所示，5倍柱體積50%乙醇可將總黃酮基本洗脫完全.

表2 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法純化總黃酮結(jié)果 %

2.1.4 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析純化 為了進(jìn)一步提高總黃酮的純度，經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮再經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20進(jìn)一步富集純化，結(jié)果見表3，第1～5 BV流分鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性，合并5 BV甲醇洗脫液，測(cè)定總黃酮含量達(dá)到(55.53 ± 2.63)%，轉(zhuǎn)移率為(82.02 ± 0.46)%.

2.1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)選的純化方法重復(fù)平行試驗(yàn)3次，測(cè)定所得總黃酮含量以及總體轉(zhuǎn)移率. 結(jié)果如表4所示，總黃酮平均含量達(dá)53.91%，平均總體轉(zhuǎn)移率為39.65%，該純化方法重復(fù)性良好，工藝可行.

表3 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20總黃酮結(jié)果 %

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3) %

2.2 華中枸骨葉總黃酮體外抗RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥活性

2.2.1 對(duì)MH7A細(xì)胞存活率影響 MTT結(jié)果如圖2所示. 華中枸骨總黃酮濃度不大于200 μg/mL時(shí)，MH7A細(xì)胞存活率無顯著差異(P> 0.05)，表明華中枸骨總黃酮在濃度不大于200 μg/mL時(shí)無明顯細(xì)胞毒性，因此，在隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中樣品濃度均不超過200 μg/mL.

2.2.2 對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞生成NO抑制作用 細(xì)胞上清液中NO濃度測(cè)定結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，模型組NO釋放量極顯著上升(#P<0.01)，說明模型組TNF-α誘導(dǎo)MH7A滑膜炎癥造模成功，在給藥濃度為50 μg/mL、100 μg/mL時(shí)，總黃酮呈劑量依賴性顯著抑制NO釋放量，抑制率分別為9.84%、32.79%；給藥濃度為200 μg/mL時(shí)，能極顯著抑制NO的釋放量，抑制率67.00%.

*P<0.05 vs 空白組

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs空白組；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型組

2.2.3 對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平抑制作用 RT-qPCR測(cè)定結(jié)果見圖4. TNF-α誘導(dǎo)后，MH7A細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平顯著或極顯著升高(#P< 0.05,##P< 0.01). 總黃酮給藥處理后，相對(duì)于模型組，華中枸骨總黃酮?jiǎng)┝恳蕾囆燥@著降低TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞炎癥因子IL-1βmRNA水平(#P<0.05)，給藥劑量為200 μg/mL極顯著降低IL-6和IL-8 mRNA水平(**P<0.01).

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs 空白組；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型組

3 結(jié)論與討論

黃酮類成分為多種天然藥物的主要活性成分，具有良好的藥理活性而被廣泛研究.本實(shí)驗(yàn)首先比較堿溶酸沉法、石油醚脫脂法初步純化華中枸骨總黃酮，結(jié)果表明乙醇總提取物經(jīng)石油醚萃取處理，總黃酮的純度和轉(zhuǎn)移率明顯升高，既能除去大量脂溶性雜質(zhì)，又有利于后續(xù)進(jìn)一步柱色譜純化.聚酰胺及大孔吸附樹脂吸附色譜在天然藥物總黃酮類成分富集純化方面應(yīng)用廣泛[12-14].本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了聚酰胺吸附色譜及D101, D101-1, DA201, DM301, DS401大孔吸附樹脂吸附對(duì)華中枸骨總黃酮的純化效果，結(jié)果表明非極性D101大孔吸附樹脂吸附，50%乙醇洗脫效果較好, 總黃酮含量達(dá)到31.58%.為了滿足藥理活性測(cè)試需要，需要進(jìn)一步提高總黃酮的純度，經(jīng)葡聚糖凝膠 Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化，最終得到總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 53.91%，總體轉(zhuǎn)移率為39.53%，重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明該方法重復(fù)性好,可作為華中枸骨總黃酮的有效富集方法.

RA是免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞等可通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生大量的炎性因子及炎性介質(zhì)，從而影響滑膜組織與周圍結(jié)締組織的正常形態(tài)和功能，參與RA關(guān)節(jié)損傷的病理進(jìn)程[15].研究結(jié)果表明華中枸骨總黃酮能夠顯著減少TNF-α誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生NO水平，降低促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的水平，顯示抗RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥潛力，提示總黃酮類成分可能為華中枸骨治療RA主要活性物質(zhì)基礎(chǔ). 本研究為華中枸骨總黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，但其抑制RA滑膜炎癥分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究.