慢性乙型肝炎相關(guān)原發(fā)性肝癌的生物標(biāo)志物：新的發(fā)現(xiàn)和未來(lái)之路

陳忠偉，樊怡昕，胡漢寧，魏艷紅，胡康洪，葉啟發(fā)

(1.湖北工業(yè)大學(xué)中德生物醫(yī)學(xué)中心， 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430068;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科， 湖北 武漢 430071； 3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院， 武漢大學(xué)肝膽疾病研究院， 湖北 武漢430071)

0 引言

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)[1]，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界第六大最常見(jiàn)的癌癥，在男性中占第五位，在女性中占第九位，也是致死率位居第二位的惡性癌癥.在世界范圍內(nèi)，約80%的肝癌是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的[2].跟蹤中國(guó)人群評(píng)估發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝病毒感染患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)比未感染人群高出約20倍[3].

在大多數(shù)情況下，HCC是在中晚期被診斷出來(lái)的，并且HCC患者的預(yù)后較差，其5年生存率不到5%[4].因此急切需要尋找肝癌的特異性生物標(biāo)志物，用于診斷早期肝癌和預(yù)后分類，從而降低肝癌死亡率和醫(yī)療費(fèi)用.目前推薦肝硬化患者的篩查策略包括測(cè)定血清甲胎蛋白(alapha-fetoprotein, AFP)水平和每6個(gè)月進(jìn)行一次腹部超聲檢查[5].對(duì)于肝臟超聲和血清AFP篩查異常者首選的影像學(xué)檢查方法是動(dòng)態(tài)增強(qiáng)CT和多模態(tài)MRI掃描.系統(tǒng)回顧顯示，B超的靈敏性為58%，特異性為94%，CT的靈敏性為68%，特異性為93%，而MRI的靈敏性為81%，特異性為85%[6].另外影像學(xué)檢查的可靠性受限于醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)，以及不同人種不同年齡患者檢測(cè)結(jié)果存在差異[7].因此，尋找新的特異性標(biāo)志物，從而更好地診斷或預(yù)測(cè)HCC仍然是一個(gè)重要的臨床關(guān)切.本文中就HBV相關(guān)HCC診斷和預(yù)后密切相關(guān)的外周血生物標(biāo)志物研究進(jìn)展作一綜述，并對(duì)其前景進(jìn)行展望.

1 常見(jiàn)乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物

1.1 糖基化的α-甲胎蛋白(AFP)長(zhǎng)期以來(lái)，α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)與腹部超聲廣泛應(yīng)用在常規(guī)的HCC篩查中.AFP是一種由胎兒卵黃囊和肝臟產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可結(jié)合外源和血液中的內(nèi)源性物質(zhì)[8].成年人血清AFP水平極低，一旦異常升高，則與急性肝炎、竇性腫瘤、肝細(xì)胞癌等多種癌癥有關(guān)[9].然而Yao等[10]的研究顯示，只有70% 的HCC患者在診斷時(shí)AFP水平明顯升高，即使在最佳檢測(cè)條件下，運(yùn)用AFP檢測(cè)HCC的靈敏度最高也只能達(dá)到75%.鑒于此，尋求準(zhǔn)確性更高的生物標(biāo)志物具有重要臨床意義.

不同疾病產(chǎn)生的糖基化的AFP，依據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)上的差異，分為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3 3種，它們?cè)谠\斷早期HCC和鑒別肝病惡性情況方面，特異性高于AFP，其中AFP-L3占血清總AFP的比例與腫瘤的惡性程度有關(guān)[11].Waidely等[12]研究提出，在AFP水平正常情況下，AFP-L3的升高也可作為HCC的診斷指標(biāo).但Witjes等[13]發(fā)現(xiàn)不同的研究使用不同的標(biāo)準(zhǔn)，限制了AFP-L3的臨床運(yùn)用潛能，其可靠性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.

1.2 骨橋蛋白(OPN)骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種與整合素結(jié)合的糖磷蛋白，是構(gòu)成骨和牙齒細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分.OPN參與了發(fā)育過(guò)程、免疫過(guò)程、致瘤過(guò)程和骨平衡過(guò)程[14].OPN在結(jié)腸癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤和其他腫瘤中均有表達(dá)，在HCC中OPN的水平高于正常組織[15].Wan等[16]發(fā)現(xiàn)，OPN的靈敏度優(yōu)于AFP(86%>66%)，但其特異性略低于AFP(86%<95%)，認(rèn)為它是一個(gè)可與AFP相媲美的潛在診斷標(biāo)志物.但由于HCC異質(zhì)性限制，需進(jìn)一步大樣本評(píng)估OPN臨床應(yīng)用的準(zhǔn)確性及OPN與AFP的聯(lián)合應(yīng)用價(jià)值.

1.3 脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)脫-γ-羧基凝血酶原(des-gamma carboxy prothrombin, DCP)，也稱血清異常凝血酶原Ⅱ(protein induced by vitamin K absence, PIVKA-Ⅱ)，是一種非羧基化的凝血酶原，已被證實(shí)是一種致癌因子并介導(dǎo)HCC增殖與侵襲[17]. Xing等[18]觀察到，和AFP相比較，無(wú)論是針對(duì)< 3 cm的小肝癌組織的診斷，還是≥3 cm的大肝癌組織的診斷，DCP的AUC值即ROC曲線下面積(area under the ROC curve, 簡(jiǎn)稱AUC)均更優(yōu)，提示DCP 是一種能夠替代AFP的診斷指標(biāo)；日本、韓國(guó)及印度批準(zhǔn)其作為HCC的有效標(biāo)志物，尤其是判斷肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和預(yù)后.但魯鳳民[19]等研究發(fā)現(xiàn)維生素K缺乏或者飲酒也會(huì)導(dǎo)致DCP含量升高，這在一定程度上會(huì)干擾診斷結(jié)果.Song等[20]將DCP與AFP結(jié)合診斷早期HCC，靈敏度高達(dá)94%，特異性高達(dá)98.5%.因此聯(lián)合不同的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，能極大提高診斷效果.

1.4 磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)磷脂酰肌醇聚糖-3(glypican-3,GPC3)是一種錨定在質(zhì)膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖.Gao等[21]研究報(bào)道GPC3通過(guò)刺激Wnt信號(hào)通路促進(jìn)肝癌生長(zhǎng).GPC3在黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肝母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，在乳腺癌、肺腺癌、膽管癌和正常肝組織中無(wú)表達(dá)，但在70%的HCC患者中高表達(dá).Dong等[22]發(fā)現(xiàn)GPC3可能是肝癌靶向性成像診斷中的理想腫瘤標(biāo)志物.Xu等[23]通過(guò)系統(tǒng)性回顧和薈萃分析發(fā)現(xiàn)，血清GPC3的靈敏度與AFP 相近(55%>54%)，但其特異性低于AFP(58%<83%).聯(lián)合AFP診斷HCC的靈敏度(85%)明顯高于單獨(dú)使用血清GP73或AFP.雖然GPC3被認(rèn)為是一種新的HCC血清標(biāo)志物，但由于HCC的異質(zhì)性，導(dǎo)致其診斷結(jié)果并不一致[24].

1.5α-L-巖藻糖苷酶(AFU)α-L-巖藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase, AFU)是一種存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的溶酶體酶.Yang等[25]報(bào)道血清AFU在乙型肝炎相關(guān)肝癌的患者中水平升高，且在多種肝癌篩查方法中，血清AFU是肝癌特異性標(biāo)志物最突出的.Mossad等[26]研究發(fā)現(xiàn)，血清AFU和鱗狀細(xì)胞癌抗原-免疫球蛋白M復(fù)合物(squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complex, SCCA-IgM)聯(lián)合診斷時(shí)，HCC和肝硬化患者SCCA-IgM和AFU水平差異顯著，可識(shí)別沒(méi)有AFP升高情況下的HCC.因此，AFU可能發(fā)展為診斷生物標(biāo)志物.

1.6 其他常用于輔助診斷HCC的抗原有癌胚抗原(CEA)、癌抗原199(CA199)、癌抗原125(CA125)、癌抗原50(CA50)及癌抗原153(CA153)等, 各醫(yī)院以多個(gè)抗原抗體的組合檢測(cè)提高HCC的診斷率，常見(jiàn)組合有AFP/CEA/CA199或AFP/CA199/CA125/CEA.此外，對(duì)于HBV相關(guān)HCC患者需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)HBV基因型和變異類型、血清HBe Ag、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和HBV DNA水平等.

2 新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物

2.1 非編碼RNA

2.1.1 微小RNA(miRNA) 微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類小的、內(nèi)源性的非編碼RNA分子，通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡多種生物學(xué)過(guò)程[27].目前miRNA被認(rèn)為是最具潛力的診斷標(biāo)志物，其中miR-21，miR-122在HBV相關(guān)肝病不同階段均有異常表達(dá)，并與AFP水平相關(guān).

miR-21參與肝臟的發(fā)育、分化、穩(wěn)態(tài)和代謝功能，以程序性細(xì)胞死亡蛋白4(programmed cell death 4, PDCD4)和磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)為靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡抗性[28].Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，外周血較高水平的miR-21與肝癌分化程度、進(jìn)展程度正相關(guān)，預(yù)示不良后果.

Hsu等[30]報(bào)道m(xù)iR-122是一種肝臟特有的miRNA，通過(guò)抑制ATK和MAPK等相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路抑制腫瘤，miR-122的缺失導(dǎo)致分化受阻、基因組不穩(wěn)定以及炎癥，Lou等[31]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的miR-122轉(zhuǎn)運(yùn)能提高HCC化療敏感性，有望成為肝癌化療的潛力策略.

目前利用miR-122, miR-21, miR-192, miR-223, miR-26a, miR-27a和miR-801等7種血漿miRNA的表達(dá)水平建立的肝癌診斷模型其靈敏度較AFP提高約30%，而且在AFP陰性的病患中，仍能做出準(zhǔn)確的診斷(敏感度可達(dá)77.7%，特異度可達(dá)84.5%)[32].基于該循環(huán)miRNA模型的肝癌檢測(cè)試劑盒已經(jīng)多中心臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(n=1 812)，并獲國(guó)家藥品監(jiān)督管理局三類醫(yī)療器械注冊(cè)證，已進(jìn)入臨床應(yīng)用.

2.1.2 環(huán)狀RNA(circRNA) 環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA) 是一種共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼 RNA 分子，不具有5’端帽子和3’端 poly(A) 尾巴，呈環(huán)狀，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和組織特異性[33].近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在HCC中有不同程度的表達(dá)，在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，可能成為HCC的診斷標(biāo)志物，但其在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起哪些關(guān)鍵作用尚不清楚.

Yu等[34]研究發(fā)現(xiàn)Cdr1as(又稱CIRS-7)通過(guò)靶向miRNA-7在肝癌中發(fā)揮癌基因作用，在肝癌組織中Cdr1as表達(dá)上調(diào)，使miRNA-7表達(dá)下調(diào).Cdr1as表達(dá)增加與肝微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)、甲胎蛋白(AFP)水平、年齡和HCC惡化密切相關(guān).Xu等[35]研究報(bào)道Cdr1as在伴有MVI的肝癌組織中的表達(dá)與miRNA-7呈負(fù)相關(guān)，與兩個(gè)miRNA-7靶基因(PIK3CD和p70S6K)呈正相關(guān).

Yu等[36]研究發(fā)現(xiàn)cSMARCA5(也稱Hsa_CIRC_0001445)是區(qū)分HCC患者與健康對(duì)照以及肝硬化或慢性乙肝患者的相當(dāng)準(zhǔn)確的標(biāo)志物.Zhang等[37]報(bào)道cSMARCA5通過(guò)海綿miRNA-17-3p和miRNA-181b-5p促進(jìn)腫瘤抑制因子TIMP3，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移.此外，cSMARCA5的低表達(dá)也可能是肝切除術(shù)后HCC患者總體生存(OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存(RFS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.

2.1.3 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNA)屬于一類長(zhǎng)達(dá)200 bp的非編碼RNA分子，廣泛存在于血漿、血清、尿液中，可作為診斷HCC或預(yù)后的潛在標(biāo)志物[38].盡管LncRNA不能編碼蛋白質(zhì)，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，它們?cè)贖CC的發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)靶向大量的關(guān)鍵蛋白編碼基因、miRNAs和信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、自噬和凋亡中起重要作用[39].

當(dāng)前研究中，由HBV或HBx引起LncRNAs失調(diào)較為關(guān)注的是HBx-LINE1 (fusion of the human cellular long interspersed nuclear elements and HBx)和Unigene56159，均只在HBV相關(guān)的HCC患者中表達(dá)，具有較好的特異性，是潛在的生物標(biāo)志物.

Lau等[40]證實(shí)HBx-LINE1是HBV DNA和宿主序列LINE1的一種特殊的嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它證明了HBV DNA可能通過(guò)整合到宿主細(xì)胞的基因組中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌發(fā)展，并且在23.3%的HBV相關(guān)HCC患者中可檢測(cè)到該基因.Liang等[41]研究表明HBx-LINE1可以作為miR-122的分子海綿，通過(guò)耗盡miR-122，促進(jìn)肝細(xì)胞β-catenin信號(hào)的激活、E-鈣黏附素的還原和細(xì)胞遷移，并導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞有絲分裂異常和肝損傷.Lv等[42]研究發(fā)現(xiàn)Unigene56159在HBV相關(guān)的HCC組織中高表達(dá)，可作為miRNA-140-5p的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA，抑制靶基因Slug的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC的細(xì)胞遷移，侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT).

2.2 病理學(xué)標(biāo)志物

2.2.1 角蛋白19(keratin 19, K19) K19是病理學(xué)常用的預(yù)后標(biāo)志物之一，其表達(dá)與射頻消融后的高復(fù)發(fā)率有關(guān)[43]. Govaere等[44]在韓國(guó)的HBV 相關(guān)HCC的隊(duì)列中確定K19的預(yù)后價(jià)值，它與腫瘤大小、腫瘤分化程度降低、轉(zhuǎn)移和微血管侵犯顯著相關(guān).Kawai等[45]證實(shí)肝癌中K19與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)途徑以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)之間的關(guān)聯(lián)，表明K19有望成為抑制TGFBR1的治療靶點(diǎn).

2.2.2 上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) EpCAM是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白.Julich-Haertel等[46]利用熒光激活細(xì)胞掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)EpCAM+與腫瘤惡性程度、預(yù)后不良相關(guān)，且具有作為HCC液體活檢標(biāo)志物的潛力，可無(wú)創(chuàng)區(qū)分肝癌患者與慢性肝硬化患者.Takai等[47]研究確定PMPCB對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的重要性，通過(guò)失活Wnt/β-catenin信號(hào)通路選擇性殺死高度耐藥的EpCAM+肝癌腫瘤.Dai等[48]采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)106例接受肝切除術(shù)的HBV相關(guān)HCC患者發(fā)現(xiàn)EpCAM+與腫瘤大小、肝硬化和血管浸潤(rùn)顯著相關(guān).

2.2.3 CD90 CD90是一種由不同類型的細(xì)胞表達(dá)的GPI錨定蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、遷移、纖維化的作用[49].Xia等[50]研究發(fā)現(xiàn)CD90激活mTOR通路對(duì)阿霉素的化療耐藥.Luo等[51]研究表明CD90+細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤性、化療耐藥性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力，因此，CD90作為肝癌的靶向治療值得進(jìn)一步研究.Zhao等[52]臨床分析顯示CD90與病理分級(jí)、衛(wèi)星病變、門靜脈癌栓和復(fù)發(fā)臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)，提示CD90是肝切除后HCC患者預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物.

2.2.4 CD133 CD133是一種與胚胎上皮細(xì)胞質(zhì)膜突起特異相關(guān)的跨膜糖蛋白.Jang等[53]研究發(fā)現(xiàn)CD133可用于維持EGFR介導(dǎo)的致癌信號(hào).此外，EGFR缺陷的CD133+肝癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性高于對(duì)照CD133+肝癌細(xì)胞，表明CD133可作為新靶點(diǎn)對(duì)耐EGFR靶向藥物的肝癌細(xì)胞增敏.Kim等[54]發(fā)現(xiàn)在HCC中CD133的過(guò)表達(dá)預(yù)測(cè)了對(duì)索拉非尼的不良反應(yīng).Song等[55]研究提示CD133在肝癌細(xì)胞活性氧防御和逃避抗癌治療中起重要作用，此外，柳氮磺胺吡啶聯(lián)合常規(guī)化療可能是治療CD133+肝癌細(xì)胞的有效策略.

2.2.5 CD13 CD13是一種膜糖蛋白，也是一種胞外肽酶，其主要功能是將單個(gè)中性氨基酸從小肽的N端裂解出來(lái).Sun等[56]報(bào)道CD13+/CD133+和CD13+/CD90+細(xì)胞不僅可以增強(qiáng)肝癌的起始性，而且可以增強(qiáng)對(duì)阿霉素(DXR)和氟尿嘧啶(5-FU)的化療耐藥性. 有趣的是，Yang等[57]在人肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CD13不僅可以被遺傳毒性化療藥物誘導(dǎo)，也可以被索拉非尼誘導(dǎo).Yamanaka等[58]研究臨床資料發(fā)現(xiàn)CD13的表達(dá)與E-cadherin、vientin等EMT標(biāo)志物的表達(dá)密切相關(guān)，提示CD13可作為術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)記物.

2.2.6 SAL樣蛋白4(Sal-like protein 4, SALL4) SALL4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖和維持多能性，Oikawa等[59]發(fā)現(xiàn)SALL4在肝癌中與細(xì)胞和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)，且與5-FU耐藥有關(guān)，可抑制分化延緩腫瘤生長(zhǎng)，表明SALL4是治療肝癌的潛在靶點(diǎn).Tsujikawa等[60]通過(guò)免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SALL4+的肝癌分化差，門靜脈浸潤(rùn)和/或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，增殖活性高.

2.3 其他除了上述介紹外，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子類標(biāo)志物具有治療HCC的潛力，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)可作為肝癌治療靶標(biāo)[61]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肝癌治療藥物索拉非尼的靶點(diǎn)之一[62]；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)有助于克服肝癌對(duì)索拉非尼的耐藥性[63]；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)/間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 (c-mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)信號(hào)通路(HGF/c-MET)的異常激活參與肝癌的發(fā)生[64]，提示抑制c-Met可能具有治療潛力.當(dāng)前國(guó)內(nèi)治療c-MET陽(yáng)性肝細(xì)胞癌處于Ia/Ib期臨床試驗(yàn)(CTR20190632).但關(guān)于此類標(biāo)志物的臨床應(yīng)用方案仍需要深入探究.

另外，還有研究者發(fā)現(xiàn)循環(huán)基因和細(xì)胞類標(biāo)志物也有潛力應(yīng)用于HCC的診斷與預(yù)后，比如循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulatng tumor cell, CTC)[65]、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[66]、AFP-mRNA[67]、游離DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)[68]等，但它們的臨床有效性依然需要驗(yàn)證.

3 未來(lái)趨勢(shì)與討論

3.1 多標(biāo)志物多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)由于HCC的異質(zhì)性，并不存在一個(gè)具有100%靈敏度和特異性的單一生物標(biāo)志物，因此，考慮如何科學(xué)優(yōu)化已知的潛在標(biāo)志物組合是一種提高診斷準(zhǔn)確率的方法.根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)出臺(tái)的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》中指出，對(duì)血清AFP陰性人群，可借助AFP-L3、PIVKA II和血漿游離微小核糖核酸(microRNA)進(jìn)行早期診斷.臨床診斷HCC利用外周血蛋白質(zhì)標(biāo)志物聯(lián)合非編碼RNA作為常規(guī)臨床指標(biāo)已成為趨勢(shì).

此外，在乙型肝炎相關(guān)肝癌的臨床診斷中大多數(shù)醫(yī)院將患者凝血功能指標(biāo)納入治療參考，包括活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplatin time, APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time, TT)、凝血時(shí)間(clotting time，CT)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)等，各醫(yī)院選取其中幾項(xiàng)檢測(cè)，稱為凝血X項(xiàng)，再結(jié)合腫瘤標(biāo)志物水平可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者凝血功能與腫瘤的情況，并予以有效的治療措施進(jìn)而減少肝臟相應(yīng)并發(fā)癥，最大程度上降低病死率.

2018年由國(guó)家肝癌科學(xué)中心/上海東方肝膽外科醫(yī)院和廣州南方醫(yī)院等多家單位進(jìn)行多中心、前瞻性萬(wàn)人隊(duì)列肝癌及早期預(yù)警標(biāo)志物篩查項(xiàng)目PerCar，該模型基于生化血清標(biāo)志物(AFP、AFP-L3、DCP)、影像學(xué)(US、CT、MRI)和血漿cfDNA高通量檢測(cè)，其靈敏度高達(dá)95.7%，特異性高達(dá)93.1%，目前該研究產(chǎn)品于2020年正式上市，可用于高危人群的早篩早診以及肝癌患者的復(fù)發(fā)監(jiān)控.

3.2 未來(lái)檢測(cè)新技術(shù)蛋白芯片技術(shù)具有高通量，高敏感度，提高診斷陽(yáng)性率等特點(diǎn)，在臨床檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物中具有較高應(yīng)用價(jià)值.功能性成像技術(shù)是基于動(dòng)態(tài)計(jì)算機(jī)斷層掃描、動(dòng)態(tài)磁共振成像和擴(kuò)散加權(quán)磁共振成像的方法，在肝癌早期診斷以及檢測(cè)纖維化程度或血管生成等方面的變化發(fā)揮越來(lái)越大的作用.數(shù)字化病理分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)多人會(huì)診，客觀快速，減少個(gè)體診斷差異，在病理學(xué)方面極有應(yīng)用前景.最后，單細(xì)胞監(jiān)測(cè)分析技術(shù)和人工智能(artificial intelligence, AI)在癌癥診斷方面初露鋒芒.在未來(lái)，聯(lián)合現(xiàn)代科學(xué)新技術(shù)與上述潛在生物標(biāo)志物，無(wú)疑是提高臨床診斷準(zhǔn)確性的重要手段.

3.3 標(biāo)志物的科學(xué)研究方法在生物標(biāo)志物研究中大規(guī)模的臨床驗(yàn)證尤為重要，Liu等[69]在4 016例的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清高爾基體蛋白73(Golgi protein 73,GP73)升高與患者肝硬化背景有關(guān)，證實(shí)血清GP73不能作為HCC的診斷指標(biāo)，而有可能成為診斷肝硬化的潛在指標(biāo).除此之外，還應(yīng)考慮不同地區(qū)種族的生物代謝特征，Costa等[70]研究證實(shí)，骨橋蛋白(OPN)和潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白(latent-TGF β binding-protein 2, LTBP2)診斷HBV相關(guān)HCC時(shí)，在相同的cut-off值下，兩種標(biāo)志物的靈敏性和特異性在各種族之間均有差異.

在生物標(biāo)志物研究中，cut-off值在區(qū)分陰性患者和陽(yáng)性患者中具有重要作用，合理的cut-off值能降低漏診率且避免不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理創(chuàng)傷，但大多數(shù)研究中，陰性血清樣本量和正常的血清樣本量均少于1 000，極少考慮解決假陽(yáng)性和假陰性的影響.鑒于此，如何科學(xué)設(shè)置cut-off值仍需要繼續(xù)研究.

到目前為止，大多數(shù)血清標(biāo)志物研究都是單中心、回顧性的研究，其中最大的問(wèn)題是缺乏可靠的科學(xué)設(shè)計(jì)和可重復(fù)驗(yàn)證的研究方法.Brazma等[71]提出需要制定標(biāo)準(zhǔn)化研究方案，以便能夠重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使結(jié)果更具有嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性.

3.4 討論理想的腫瘤標(biāo)志物除了具有高靈敏性和高特異性, 還應(yīng)具有操作方便、靈敏可靠、價(jià)格低廉、微創(chuàng)甚至無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，但生物體液中RNA的數(shù)量和質(zhì)量都很低，加大了檢測(cè)難度.在個(gè)體之間，甚至在健康人群中外周血RNA存在變異，使得可作為潛在生物標(biāo)志物的外周血RNA轉(zhuǎn)換為臨床診斷指標(biāo)更加復(fù)雜.因此，外周血RNA能否作為可行的生物標(biāo)志物仍有很多技術(shù)瓶頸亟待解決.

肝癌發(fā)展過(guò)程極為復(fù)雜結(jié)果極為嚴(yán)重，需要更全面更系統(tǒng)的研究，未來(lái)在臨床上尋找患者亞類的生物標(biāo)志物可能有更好的診斷與治療效果.雖然聯(lián)合診斷提高了靈敏度和特異性，但也增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，現(xiàn)實(shí)往往需要兼顧治療效果和患者經(jīng)濟(jì)能力.總而言之，對(duì)肝癌腫瘤標(biāo)志物研究并開(kāi)發(fā)新型有效的標(biāo)志物仍然道阻且長(zhǎng).