葡萄糖氧化酶在蘋果汁中的抗氧化作用評價

楊玉賢，肖文靜，段壘，胡攀，江正兵，李華南

(1.湖北大學生命科學學院， 湖北 武漢 430062; 2.武漢新華揚生物股份有限公司， 湖北 武漢 430074)

0 引言

蘋果是我國產(chǎn)量最大的水果之一，資源非常豐富.蘋果中含有大量的蘋果多酚、三萜、植物甾醇、維生素及其他微量元素[1]，有較高的抗氧化性、抗惡性細胞增殖性和化學防護作用[2].蘋果榨汁便是一種便捷營養(yǎng)的健康飲品.但是，在生產(chǎn)加工及儲藏過程中易受到褐變的影響，使其觀感與營養(yǎng)風味大大降低.因此針對蘋果汁的抗氧化褐變是果汁生產(chǎn)商關注的重點.蘋果汁中存在的多酚氧化酶是導致褐變的一個重要因素，它可以氧化果汁中的多酚類化合物使其生成具有顏色的醌類.有研究表明蘋果中的總多酚、原花青素、兒茶素、氯菌素與褐變有較高的相關性[3].

目前控制褐變過程的主要策略是抑制多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性或將醌類化合物轉化為無色物質[4].亞硫酸鹽是眾所周知的還原劑，曾是有效和最常用的抗褐變劑[5].但是，它對人體有不良影響.因此亞硫酸鹽的使用受到限制[6].抗壞血酸也是一個較好的抗褐變劑[7]，其在較高濃度(>1.5%)時立即將形成的醌還原為無色底物，而低濃度則作為PPO競爭性抑制劑[4].其他一些研究發(fā)現(xiàn)從肉桂中提取的香豆素[8]、綠茶提取物[9]、植酸[10]、活性羰基[11]等都可以抑制蘋果汁的褐變.其次，從PPO的源頭釋放方面來看，由于PPO在完整活細胞中存在于質體和葉綠體中，多酚存在于液泡中，從而不會發(fā)生褐變[12].強剪切力會使細胞受到嚴重損傷導致PPO大量釋放，因此使用溫和低速研磨的方式也可以減輕果汁褐變[13].

PPO對果汁中的多酚化合物的氧化需要氧氣的參與.因此，減少果汁中的氧氣可以有效降低PPO的活性.本研究采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)作為抑制褐變的添加劑，探究降低氧含量對褐變帶來的影響.GOD是一種需氧脫氫酶，在有氧條件下能高度專一地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[14].GOD目前應用在食品行業(yè)一方面可以轉化葡萄糖，改善鮮蝦等加工貯存中美拉德反應帶來的褐變[15].另一方面可以消耗氧氣，抑制好氧微生物的生長繁殖從而達到保鮮目的[16].且GOD已經(jīng)被證實對人體安全無毒.目前，已用作各種食品添加劑來達到保鮮效果[17-18].本研究從加入GOD的方式及劑量對蘋果汁褐變、果汁中含氧量、多酚氧化酶活性及多酚類物質含量變化的影響等因素綜合評價GOD在蘋果汁制備及儲存中的抗氧化作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑蘋果品種為紅富士，購自武漢本地超市保存于4 ℃直至使用；GOD(GenBank no.X16061.1)由已構建的重組畢赤酵母GS115發(fā)酵所得；磷酸鹽等無機試劑，甘油，葡萄糖均購自國藥集團有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone，PPVP)、辣根過氧化物酶購自Biosharp，鄰苯二酚購自Macklin.

1.2 儀器與設備JYL-C051榨汁機 中國九陽公司；M-100生物傳感分析儀 中國西爾曼公司；HQ30 d便攜式溶氧儀 美國HACH公司.

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶(GOD)的制備及酶活測定方法 將YPD活化的種子液接入裝有20 L BSM培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行分批培養(yǎng)，28%氨水調節(jié)pH為6.0，通氣量保持2.0 vvm，轉速自動控制溶氧≥10%.當葡萄糖耗盡后溶氧迅速升高，此時開始每小時取樣檢測葡萄糖的濃度，并以6.4 mL/(L·h)流加補料生長培養(yǎng)基10～20 h，至菌體干重80～90 g/L.停止葡萄糖流加后讓菌體饑餓2 h后，緩慢補入甲醇誘導培養(yǎng)基，密切注意溶氧不低于10%，4 h后菌體完全適應了甲醇的代謝，進行誘導表達培養(yǎng)，采用最大轉速800 r/min，誘導培養(yǎng)約130 h.誘導發(fā)酵完成后進行初步純化.

GOD酶活測定參考Sigma的方法.稱取0.1 g鄰聯(lián)茴香胺溶于10 mL甲醇中作為儲存液，使用前取0.1 mL于12 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)中.在試管中加入2.5 mL鄰聯(lián)茴香胺溶液,0.3 mL 18%的D-葡萄糖溶液和0.1 mL辣根過氧化物酶溶液(90 U/mL)，30 ℃保溫5 min，加入待測葡萄糖氧化酶，反應3 min后加入2 mol/L H2SO4終止反應，在540 nm下測定反應液吸光值.以稀釋的葡萄糖氧化酶標準品做標準曲線.GOD酶活單位(U)定義為該條件下，每分鐘催化1 μmolD-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫的酶量.

1.3.2 蘋果汁的制備與處理 將蘋果從冰箱取出后洗凈去皮，切成約2 cm × 2 cm小塊，每50 g蘋果加入200 mL純水至榨汁機中榨制30 s，8層紗布過濾.向每20 mL果汁中分別加入體積比為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的GOD.經(jīng)初步純化稀釋后測定GOD酶活為1 013 U/mL，至終體系中GOD分別為0、2、4、6、8、10 U/mL.對照組分別將以上不同量的GOD加入到蘋果與水的混合物中同步榨汁，后續(xù)操作相同.

1.3.3 果汁褐變度的測定 用Bonggi Lee等人提出的分光光度法測定鮮蘋果汁的褐變指數(shù)[19]，以A420表示.將制備好的蘋果汁以10 000 g離心2 min，取上清，用分光光度計在10 mm比色皿中測定在420 nm處的吸光度值.用吸光度值表示果汁的褐變程度，吸光度值越大表示果汁褐變程度越大.

1.3.4 溶解氧含量與葡萄糖含量的測定 取加入GOD同步榨取的蘋果汁立即測定其中的溶解氧含量.溶氧儀校準后置于新鮮榨取的果汁中，待讀數(shù)穩(wěn)定后直接讀出氧氣質量濃度.

取以上制備的果汁各10 mL，置于100 ℃水浴鍋中15 min使GOD失去活性，稀釋后用葡萄糖分析儀生物傳感器測定溶液中的葡萄糖含量.葡萄糖標準溶液定標，上樣測定果汁溶液，讀出葡萄糖質量濃度.

1.3.5 多酚氧化酶(PPO)的提取與測定 PPO的提取與測定根據(jù)已有方法[20]稍作改動.以PVPP作為酚類清除劑，向10 mL蘋果汁中加入4 % PVPP(w/v)劇烈搖晃，12 000 r/min離心5 min，上清液即作為粗酶液.PPO活性的測定以鄰苯二酚為底物，向反應體系中加入新鮮配制的50 mmol/L鄰苯二酚1.0 mL，1.0 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 6.5)，酶提取物1.0 mL.鄰苯二酚溶液和磷酸鹽緩沖液在使用前在30 ℃溫浴，記錄反應一分鐘在400 nm處的吸光度值變化.PPO酶活性單位(U)定義為在該條件下每分鐘使吸光度值增加0.001所需的酶量.

1.3.6 多酚類化合物的測定 委托青島科創(chuàng)質量檢測有限公司對果汁樣品進行代謝物全譜分析，通過色譜串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)技術鑒定樣品中小分子化合物，測定部分多酚類化合物的相對質量濃度.使用LC-MS儀器分析平臺，C18色譜柱進行分離.使用Compound Discoverer 3.0進行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作，根據(jù)二級質譜信息利用Thermo mzCloud在線數(shù)據(jù)庫、Thermo mzValut本地數(shù)據(jù)庫，進行物質鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析每組處理重復3次.結果表示為平均值 ± 標準差.使用SPSSAU-在線SPSS分析軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.當p<0.05時被認為有顯著差異.使用Excel對實驗數(shù)據(jù)作圖.

2 結果與分析

圖1 GOD對果汁褐變的影響

2.1 GOD的添加量及添加時間對果汁褐變度的影響蘋果汁中加入GOD可有效降低其氧化褐變程度，本實驗比較了GOD的添加量及加入時間對褐變影響的差異.研究發(fā)現(xiàn)加入GOD同步榨汁可更有效地減輕褐變程度(圖1).榨制前加入0.2% GOD可使蘋果汁在420 nm處的吸光度值降低42%，榨取后加入GOD僅降低了18%.這是因為在果汁榨制的過程中，榨汁機刀片的高速轉動使果汁與空氣的接觸面積大大增加，這極大提高了果汁中的氧氣含量使PPO快速作用從而發(fā)生褐變，榨制前加入的GOD可快速消耗果汁中的氧氣從而減緩PPO的作用.隨著GOD的添加量增多，其抑制作用效果并沒有顯著提高(p>0.05).GOD對果汁褐變作用的視覺效果見圖2，在觀感上添加0.2%的GOD與更高添加量無顯著差異，因此，從經(jīng)濟學角度考慮實際應用中可以選擇加入果汁體系體積0.2%的GOD.

A：不加GOD； B：0.2% GOD； C：0.4% GOD； D：0.6% GOD； E：0.8% GOD； F：1.0% GOD

將未添加GOD與添加了0.2% GOD的果汁裝瓶置于4 ℃儲存，每5天測定一次吸光度值.結果表明，第20天時未加酶處理的果汁褐變度增加了約79.2%，而用GOD處理后褐變度僅增加了18.6%(圖 3).這表明GOD對果汁的抗氧化有長期穩(wěn)定的作用.

圖3 GOD在果汁儲存中的抗褐變作用

圖4 GOD對果汁溶氧及葡萄糖含量的影響

2.2 GOD的添加對果汁中溶解氧含量的影響通過測定果汁中的氧氣含量，發(fā)現(xiàn)未加入GOD的果汁榨取結束時溶解氧含量為4.0 mg/L；加入GOD的果汁榨制結束時溶解氧含量減小了至少20倍，均低于0.2 mg/L(圖 4).說明在榨汁過程中GOD消耗了果汁中的大量氧氣，這就解釋了為什么加入GOD同步榨汁可以更有效地降低果汁的褐變程度.隨著GOD的增加，果汁中的氧氣含量下降并不顯著(p>0.05).因此，抑制褐變的效果沒有明顯增強.

2.3 GOD的添加對葡萄糖及葡萄糖酸含量的改變通過測定果汁中的葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)加入GOD 1 h后果汁中的葡萄糖含量有明顯降低，加入0.2%的GOD使葡萄糖含量降低了約10%(圖 4).HPLC-MS/MS測定得到經(jīng)過GOD處理的果汁中葡萄糖酸的相對含量達11.79 mg/L，未處理的僅0.09 mg/L.而且葡萄糖酸被認為是一種安全的食品添加劑，通常被添加到乳制品和軟飲料中以保持其感官特性[21].

2.4 GOD的添加對PPO活性的影響眾所周知，PPO會引起果汁的褐變.進一步分析了加入GOD對PPO活性的抑制作用.結果表明，GOD對果汁中的PPO活性有顯著影響(p<0.05)，加入0.2%的GOD就可抑制67.5%的PPO活性，這就使得果汁的褐變程度大大降低(圖5).隨著GOD添加量的增加抑制作用增強，主要是因為GOD消耗了果汁中的大量氧氣，從而競爭性地抑制了PPO的需氧氧化.

圖5 GOD對果汁中多酚氧化酶活性的影響

圖6 GOD對果汁中部分多酚類化合物的影響

2.5 GOD的添加對多酚化合物含量的影響氧氣濃度低于5%，可以通過PPO控制蘋果中酚類底物的氧化[22].本研究測定了蘋果汁中部分多酚類化合物的相對質量濃度(圖6)，測定結果表明未經(jīng)過GOD處理的果汁中不含兒茶素和綠原酸.綠原酸是大多數(shù)品種蘋果果實中的主要成分，并且是PPO的最佳內(nèi)源性底物[23].表明未經(jīng)處理的蘋果汁中更高的PPO活性產(chǎn)生作用，將綠原酸等多酚類化合物氧化.

此外，GOD的加入使蘋果汁中的5-羥甲基糠醛減少了0.2 μg/mL，不加GOD的果汁中為5.48 μg/mL.5-羥甲基糠醛是美拉德反應、焦糖化反應及抗壞血酸氧化分解反應的共同中間產(chǎn)物[24]，且與果汁的褐變呈指數(shù)關系[25].因此，5-羥甲基糠醛的減少對果汁褐變的抑制是有利的.

3 討論

在果汁抗氧化中的添加劑力求天然無害，不破壞果汁本身的營養(yǎng)風味，并且果汁生產(chǎn)經(jīng)濟便捷.GOD作為一種抗褐變添加劑基本符合以上幾點要求.目前，有報道在真空下研磨蘋果汁以達到分離氧氣的作用，該作用可有效抑制果汁的褐變[26].但是，在實際應用中并不便捷，對于小型應用場所例如餐廳、咖啡廳來說較難達到使用條件，因此，榨制前加入GOD可快速消耗果汁中的氧氣從而減緩PPO的作用，達到抑制蘋果汁褐變的目的，具有方便經(jīng)濟快捷等優(yōu)點.研究發(fā)現(xiàn)通過GOD處理的蘋果汁，糖含量可降低21%，餐后血糖和靜脈血清胰島素響應分別降低68%和47%，導致血糖負荷降低74.6%，而且沒有任何不良的胃腸道副作用[27]. 本研究表明GOD的添加使果汁中的糖含量降低，這對空腹血糖受損病人是有利的，也符合當代人低熱量健康飲食的理念.GOD消耗果汁中的大量氧氣，而較低的氧濃度可用于在貯藏期間保持新鮮水果中更高水平的酚酸和維生素C[28]，且有一些研究已表明多酚化合物具有抗氧化、抗癌[29]、降血壓[30]等特性，此酶處理對果汁營養(yǎng)的保留具有積極作用.GOD作為一種具有活性的酶蛋白，在實際儲存運輸中可能存在一定的限制，未來的研究中可以嘗試與其他添加劑聯(lián)合使用以增強其商業(yè)穩(wěn)定性.

4 結論

本研究通過對蘋果汁褐變度、果汁中含氧量、多酚氧化酶活性及多酚類物質含量等因素的測定綜合評價了GOD在蘋果汁制備及儲存中的抗氧化作用.選擇榨汁過程中同步加入GOD可以比榨汁后加入更有效地抑制果汁褐變，添加果汁體系體積0.2%的GOD就能達到較好的抗氧化效果.GOD的加入使果汁含氧量降低95%，同時減少果汁葡萄糖含量.通過抑制67%的PPO活性保留了兒茶素和綠原酸等多酚類化合物，使果汁的營養(yǎng)更豐富.