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    miR-92b與PI3K/Akt在糖尿病腎病中相關(guān)性的初步研究

    2021-01-05 13:13:08申永超林佳馮琪朱大榮
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2021年30期
    關(guān)鍵詞:小鼠糖尿病實驗

    申永超 林佳 馮琪 朱大榮

    [摘要] 目的 探討miR-92b與信號通路PI3K/Akt在糖尿病腎病中的相關(guān)性。 方法 選取8周齡的C57BL/6 雄性小鼠12只,隨機分為正常對照組和糖尿病腎病組,利用枸櫞酸鈉建立糖尿病腎病小鼠模型;選取人腎小管上皮HK-2細(xì)胞12瓶,隨機分為高糖組、低糖組和左旋葡萄糖組,用高糖刺激建立糖尿病腎病細(xì)胞模型。利用實時熒光定量PCR檢測小鼠腎臟組織和細(xì)胞中miR-92b表達水平,Western blot檢測小鼠腎臟組織和細(xì)胞中Akt和P-Akt的表達水平。 結(jié)果 糖尿病腎病組和高糖組miR-92b表達水平明顯低于對照組(P<0.05),而P-Akt/Akt表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。將信號通路PI3K/Akt抑制劑LY294002加入到高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病細(xì)胞模型中,信號通路PI3K/Akt被抑制的同時,miR-92b表達顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 糖尿病腎病時,miR-92b與PI3K/Akt的表達呈負(fù)相關(guān)。

    [關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病;miR-92b;PI3K;Akt;LY294002

    [中圖分類號] R587.2;R364.3? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701(2021)30-0044-05

    [Abstract] Objective To explore the relationship between miR-92b and PI3K/Akt signaling pathway in diabetic nephropathy. Methods Twelve 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into a normal control group and a diabetic nephropathy group. The diabetic nephropathy mouse model was established using sodium citrate. 12 bottles of human renal tubular epithelial HK-2 cells were selected and randomly divided into high glucose group, low glucose group and L-glucose group. The diabetic nephropathy cell model was established with high glucose stimulation. The expression levels of miR-92b in mouse kidney tissues and cells were detected by RT-PCR. The expression levels of Akt and P-Akt in mouse kidney tissues and cells were detected by Western blot. Results Compared with that of the control group,the expression level of miR-92b in the kidney tissue and cells of the diabetic nephropathy model group was significantly lower (P<0.05), and the expression level of P-Akt/Akt was significantly higher(P<0.05). The PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002 was added to the high glucose-induced diabetic nephropathy cell model. While PI3K/Akt signaling pathway was inhibited, the expression level of miR-92b was significantly increased(P<0.05). Conclusion In diabetic nephropathy, miR-92b is negatively correlated with the expression of PI3K/Akt signaling pathway.

    [Key words] Diabetic nephropathy; miR-92b; PI3K; Akt; LY294002

    糖尿病腎?。―iabetic nephropathy,DN)是由糖尿病長期遷延不愈而致的腎臟微血管并發(fā)癥,已是當(dāng)前引起全球終末期腎臟疾病的主要病因之一[1]。由于導(dǎo)致DN的病因復(fù)雜多樣,醫(yī)學(xué)治療效果有限,目前臨床仍不能徹底治愈DN,只能維持治療,延緩進展至終末期腎病。有研究表明[2],microRNA-92b(miR-92b)可通過激活DOC-2/DAB2相互作用蛋白(DAB2 interactive protein,DAB2IP)下游信號通路PI3K/AKT促進胃癌細(xì)胞的生長,而此信號通路又在DN足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞凋亡和腎小管細(xì)胞間質(zhì)化等關(guān)鍵病變過程中起著不可替代的作用[3-5]。提示miR-92b與PI3K/AKT信號通路可能在DN病理變化中具有一定的相關(guān)性,目前國內(nèi)外尚未見與此相關(guān)的文獻報道。因此,為深入研究DN的發(fā)病機制,尋找治療DN新的靶基因,本研究擬初步探究miR-92b與PI3K/AKT信號通路在DN中的表達情況及相關(guān)性,為進一步深入研究miR-92b與PI3K/AKT信號通路在DN病理變化過程中的具體機制做準(zhǔn)備。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    雄性C57BL/6小鼠(上海斯萊克公司);人腎小管上皮HK-2s細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);小鼠代謝籠(美國Columbus);鏈佐星(美國Sigma);miR-92引物(廣州瑞博生物科技有限公司);SYBRGreenMaster(瑞士Roche);DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(上海聯(lián)碩);胰酶(美國Gibco);LY294002抑制劑(北京百奧萊博科技有限公司);鼠源性P-Akt及Akt單克隆抗體、抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶HRP(英國Abcom);RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞士Roche);BSA封閉液及RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司);PVDF膜(美國MiLipore);CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo);MyCycler PCR擴增儀(美國伯樂公司);實時定量PCR儀(美國Life Technologies)。

    1.2 糖尿病腎病小鼠模型的建立

    把12只C57BL/6(8周齡)雄性小鼠隨機分為糖尿病腎病實驗組(Dia組)和正常對照組(Con組),禁食12 h后稱體重并測量空腹血糖。Dia組按70 mg/kg左下腹注射用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制的鏈佐星溶液,兩日注射1次,共3次;Con組也按70 mg/kg左下腹注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液,2 d注射1次,共3次。兩組小鼠在同一動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)飲食,每3天換一次墊料,并觀察小鼠飲水、飲食、排尿的變化。連續(xù)3 d隨機測定兩組小鼠血糖值,若Dia組小鼠血糖值≥16.67 mmol/L,建立的糖尿病模型已達標(biāo)。再繼續(xù)喂養(yǎng)3個月,DN小鼠模型(1型)基本建立成功。

    1.3 糖尿病腎病細(xì)胞模型的建立

    以人腎小管上皮細(xì)胞HK-2為實驗對象,采用高糖誘導(dǎo)的方法建立糖尿病腎病細(xì)胞模型。按實驗要求培養(yǎng)12瓶HK-2細(xì)胞,隨機分為三組:高糖組(HG組)、低糖組(LG組)和左旋葡萄糖組(DG組),每組4瓶。三組細(xì)胞均以無血清培養(yǎng)基饑餓24 h后,按實驗要求加入干預(yù)因素刺激24 h,HG組用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激;LG組用5 mmo/L右旋葡萄糖刺激;DG組用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激。24 h后收集細(xì)胞用于RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及免疫印跡試驗(Western blot)。

    1.4 小鼠標(biāo)本的收集及指標(biāo)測定

    小鼠造模期間每周稱體重,每隔2周經(jīng)小鼠尾靜脈取血液標(biāo)本并測血糖值。處死小鼠前1 d用代謝籠收集24 h尿液標(biāo)本,檢測尿液中微量白蛋白(Microalbunminuria,MAU)和尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖甙(Urinary N-acetylbeta-D glucosamine glucoside enzyme,NAG)。處死小鼠,稱體重后解剖小鼠,取腎組織,記錄各組小鼠腎臟重量,計算腎指數(shù)(腎重量/小鼠體重)。

    1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

    HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中,選取對數(shù)生長期細(xì)胞,傳代于24個細(xì)胞瓶中,按實驗要求平分為6組,分別為-LY294002的HG組、LG組、DG組和+LY294002的HG組、LG組、DG組。-LY294002的HG組、LG組和DG組細(xì)胞按1.3實驗方法進行高糖刺激,+LY294002的HG組、LG組和DG組細(xì)胞用高糖刺激的同時加入LY294002(25 μmol/L),加入LY294002 1 h后收集細(xì)胞,為進行RT-PCR做準(zhǔn)備。

    1.6 RNA提取與RT-PCR檢測

    按照RNA提取試劑盒操作說明書對小鼠腎組織和HK-2細(xì)胞進行總RNA提取,然后紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后配制RT-PCR混合反應(yīng)體系(2 μL的cDNA、0.8 μL的RT引物、6.4 μL的SYBR Green Mix和10 μL無菌蒸餾水,共20 μL)。反應(yīng)條件為50℃,2 min;95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min;增至40個循環(huán)。PCR儀把U6作為內(nèi)參對實驗結(jié)果進行分析。

    1.7 Western blot檢測

    用裂解液對小鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞進行裂解后,4℃,12 000 rpm,離心5 min,取上清分裝至0.5 mL離心管中。測定蛋白質(zhì)濃度,并用酶標(biāo)儀在562 nm處測定紫外吸收峰,算出蛋白濃度后并對蛋白樣品進行處理。配制分離膠和堆積膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,雙抗4℃孵育,蛋白顯影。用Image J圖像分析軟件對實驗結(jié)果進行灰度分析。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

    本研究所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,計量資料用(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用one-way Anova檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 建立糖尿病腎病小鼠模型的結(jié)果

    糖尿病腎病小鼠模型建立后,測兩組小鼠體重、腎指數(shù)、血糖。與Con組相比,Dia組體重明顯降低(P<0.01),腎指數(shù)、血糖顯著升高(P<0.001)。見圖1。同時為了驗證Dia組小鼠合并腎臟并發(fā)癥,測小鼠24 h尿液中MAU、NAG含量。與Con組相比,Dia組MAU、NAG含量顯著升高(P<0.05)。見圖2。

    2.2 miR-92b、P-Akt和Akt在糖尿病腎病小鼠模型中的表達檢測

    通過對小鼠腎臟組織miR-92b的表達分析,發(fā)現(xiàn)Dia組明顯低于Con組(P<0.05)。見圖3。通過Western blot對小鼠腎臟組織Akt、P-Akt顯影,灰度分析發(fā)現(xiàn),與Con組相比,Dia組P-Akt/Akt比值明顯升高(P<0.05)。見圖4。

    2.3 miR-92b、P-Akt和Akt在糖尿病腎病細(xì)胞模型中的表達檢測

    采用高糖針對HK-2s細(xì)胞株進行24 h誘導(dǎo)建立糖尿病腎病細(xì)胞模型,通過對各組細(xì)胞miR-92b的表達檢測分析,與LG組相比,HG組miR-92b明顯表達量降低(P<0.001)。見圖5。Western blot檢測各組細(xì)胞中P-Akt和Akt表達水平,與LG組相比,HG組細(xì)胞中P-Akt/Akt比值明顯升高(P<0.05)。見圖6。

    2.4 加入抑制劑LY294002后糖尿病腎病細(xì)胞模型中miR-92b的表達檢測

    仍選用HK-2為研究對象,通過RT-PCR分析加入LY294002后各組細(xì)胞中miR-92b的表達量,-LY294002的HG組細(xì)胞中miR-92b表達量仍然明顯低于-LY294002的LG組(P<0.001)。而+LY294002的HG組細(xì)胞中miR-92b表達量明顯高于-LY294002的HG組(P<0.001)和LG組(P<0.05)及+LY294002的LG組(P<0.001)。見圖7。

    3 討論

    DN不僅是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,也是引起糖尿病死亡的主要病因之一。目前,DN臨床治療尚無有效的治療措施,除非腎移植,但腎移植不僅腎源難尋,移植后需長期服用免疫抑制劑,還不能防止DN的再發(fā)生和改善其他糖尿病并發(fā)癥。隨著病情的蔓延,患者將最終因腎功能衰竭而死亡。DN的病變涉及到多種因素,如代謝、高血壓、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等,它們或單一因素或多因素相互作用共同導(dǎo)致DN[6-7]。因DN病因復(fù)雜,本研究對防治DN的有效措施難以尋找。

    miRNA的發(fā)現(xiàn)為研究DN的基因病變和基因治療指明了新的方向。miRNA是一種在生物種內(nèi)高度保守的小非編碼RNA分子,主要通過信使RNA(mRNA)的翻譯抑制或降解來調(diào)節(jié)各種基因表達,從而調(diào)節(jié)機體正常發(fā)育和各種疾病的病理演變過程[8-12]。以往學(xué)者的研究表明,miR-92b作為一種癌基因,其異常表達與腫瘤大小、腫瘤分化和較差的總體生存率密切相關(guān),如胃癌、乳腺癌、宮頸癌等[2,13-14]。本研究顯示,無論是體內(nèi)實驗還是體外實驗結(jié)果,與正常對照組相比,miR-92b在小鼠和細(xì)胞DN模型組的表達明顯下降,表明miR-92b不僅是一種癌基因,還在機體高血糖時表達異常,并且與DN病變相關(guān)。

    PI3K于1985年被發(fā)現(xiàn),是一種磷酸化磷脂酰肌醇的脂質(zhì)激酶,磷脂酰肌醇是真核細(xì)胞膜的組成部分[15]。激活受體酪氨酸激酶(RTKs)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)通過激活Ras,進而激活PI3K。活化的PI3K使底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(P1P2)磷酸化,在真核細(xì)胞內(nèi)膜上形成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(P1P3),隨后募集信號蛋白,如Akt蛋白[16-17]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,需通過兩個關(guān)鍵的磷酸化過程被激活。首先,PIP3與Akt和磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)結(jié)合,促使PDK1磷酸化AKT蛋白的蘇氨酸308位點,導(dǎo)致AKT部分被激活,隨后通過mTOR復(fù)合物2(mTORC2)磷酸化Akt蛋白的絲氨酸473位點,激活A(yù)kt的全部酶活性,該活化過程由PI3K依賴性機制激活[18]。所以Akt被磷酸化的前提是PI3K被激活。數(shù)十年已經(jīng)過去了,PI3K/Akt通路由于其有多種功能,仍然是當(dāng)今科研的熱點。已有研究表明,機體高血糖時,異常表達的miRNA可通過激活的PI3K/Akt通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)機制[19-21]。本研究體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,Dia組小鼠腎組織P-Akt/Akt比值升高;體外實驗結(jié)果顯示,與LG組相比,HG組細(xì)胞P-Akt/Akt比值同樣升高。P-Akt/Akt比值升高,說明DN時PI3K被激活,Akt磷酸化水平升高,即PI3K/Akt通路被激活,這與以往學(xué)者的研究結(jié)果一致。

    以上研究結(jié)果表明,DN時miR-92b表達下調(diào),信號通路PI3K/Akt活性表達上調(diào)。那么是否在DN病變過程中miR-92b與信號通路PI3K/Akt存在關(guān)聯(lián)性?為此,本研究仍以HK-2細(xì)胞為研究對象,向高糖誘導(dǎo)的DN細(xì)胞模型中加入PI3K抑制劑LY294002,實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中的miR-92b。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與-LY294002的HG組、-LY294002的LG組和+LY294002的LG組相比,+LY294002的HG組miR-92b表達水平升高,說明當(dāng)DN病變時,抑制信號通路PI3K/Akt可以上調(diào)miR-92b表達水平。

    綜上所述,DN病變時,miR-92b表達下調(diào),miR-92b表達水平與PI3K/Akt活性呈負(fù)相關(guān)性。此次研究僅對miR-92b和PI3K/Akt在DN病變時的表達變化及其關(guān)聯(lián)性進行了初步研究,但為進一步研究miR-92b與PI3K/Akt在DN病變中的具體調(diào)節(jié)機制和尋找治療DN新的靶基因做了預(yù)實驗準(zhǔn)備。

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    (收稿日期:2020-11-08)

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