蓬莪術(shù)吉瑪烷型倍半萜化學(xué)成分研究

李小翠，陳金鳳，熊 亮，彭 成，郭 力*，劉 菲*

蓬莪術(shù)吉瑪烷型倍半萜化學(xué)成分研究

李小翠1, 2，陳金鳳1, 2，熊 亮1, 2，彭 成1，郭 力1, 2*，劉 菲1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137

研究蓬莪術(shù)根莖中吉瑪烷型倍半萜化學(xué)成分及其抗血小板聚集活性。采用硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜、反相中壓液相色譜、制備薄層色譜及半制備高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化，運(yùn)用現(xiàn)代波譜學(xué)手段鑒定各化合物的結(jié)構(gòu)，采用計(jì)算電子圓二色譜（ECD）方法確定新化合物的絕對(duì)構(gòu)型；對(duì)分離得到的相應(yīng)化合物分別進(jìn)行了體外腺苷-5′-二磷酸鈉鹽（ADP）及花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)的抗血小板聚集活性篩選。從蓬莪術(shù)莖95%乙醇提取物的中醋酸乙酯及正丁醇萃取部位共分離得到8個(gè)吉瑪烷型倍半萜，分別鑒定為新蓬莪術(shù)環(huán)氧酮（1）、curdionolide B（2）、curdionolide A（3）、(?)-phaeocaulin A（4a）、(+)-phaeocaulin A（4b）、heyneanone C（5）、(4,5)-13-hydroxygermacrone 4,5-epoxide（6）、phagermadiol（7），測(cè)試了分離所得化合物1～3、6對(duì)ADP及AA誘導(dǎo)的抗血小板聚集活性。共從蓬莪術(shù)中分離得到8個(gè)吉瑪烷型倍半萜，其中化合物1為新化合物，并通過(guò)計(jì)算ECD確定了絕對(duì)構(gòu)型，其對(duì)ADP及AA誘導(dǎo)的血小板聚集具有一定的抑制作用；化合物4a和4b為一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體；化合物2、3、5、6均為首次從蓬莪術(shù)中分離得到。

蓬莪術(shù)；吉瑪烷型倍半萜；計(jì)算電子圓二色譜；抗血小板聚集活性；新蓬莪術(shù)環(huán)氧酮

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Val.、廣西莪術(shù)S. G. Lee et C. F. Liang或溫郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥根莖，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，藥用歷史悠久，具有行氣破血、消積止痛的功效，臨床上常用于治療痛經(jīng)、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛等婦科疾病和心血管疾病[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，莪術(shù)具有抗血小板聚集、抗血栓、抗炎、抗腫瘤等活性，有效成分主要為揮發(fā)油和姜黃素類成分，其中揮發(fā)油以倍半萜為主[4?8]。目前對(duì)莪術(shù)“活血”功效研究多集中于提取物、姜黃素類化合物及莪術(shù)二酮等量大的萜類成分，生物活性涉及抗血小板聚集、抗血栓等，可見(jiàn)關(guān)于莪術(shù)萜類單體成分的活血作用相關(guān)研究還明顯不足[9-11]?；诖怂伎?，本課題組前期選擇川產(chǎn)道地藥材蓬莪術(shù)進(jìn)行了一系列探索，通過(guò)抗血小板聚集活性篩選發(fā)現(xiàn)莪術(shù)萜類及姜黃素類成分均具有抗血小板聚集活性，但萜類強(qiáng)于姜黃素類成分?？梢?jiàn)，萜類成分可能是莪術(shù)傳統(tǒng)功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，是除姜黃素類以外非常值得重視的另一類藥效物質(zhì)，其對(duì)全面揭示莪術(shù)的活血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

因此，為進(jìn)一步闡明莪術(shù)傳統(tǒng)功效的藥效物質(zhì)，本課題在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)莪術(shù)萜類成分進(jìn)行了研究，共分離得到8個(gè)吉瑪烷型倍半萜（圖1），經(jīng)波譜解析分別鑒定為(1,4,5,9,10)- 9-hydroxy-zederone epoxide（1）、curdionolide B（2）、curdionolide A（3）、(?)-phaeocaulin A（4a）、(＋)-phaeocaulin A（4b）、heyneanone C（5）、(4,5)-13-hydroxygermacrone 4,5-epoxide（6）、phagermadiol（7）。其中化合物1為新化合物，命名為新蓬莪術(shù)環(huán)氧酮（neozederone epoxide），利用計(jì)算電子圓二色譜（ECD）確定了其絕對(duì)構(gòu)型，化合物4a和4b為一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體?；衔?、3、5、6均為首次從蓬莪術(shù)中分離得到。最后對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了體外腺苷-5′-二磷酸鈉鹽（ADP）及花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)的抗血小板聚集活性篩選。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Büchi Gradient Former B-687中壓液相色譜儀（Rp C18，40～60 μm，Welch公司）；半制備型C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，Welch公司）；分析型C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm，美國(guó)Agilent公司）；Chiralpak AD-H手性柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，手性拆分柱，日本大賽璐公司）；圓二色譜儀（Chirascan CD光譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司）；Agilent Technologies 1100 Series高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Waters Synapt G2高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；Bruker AVIII HD-600核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Anton Paar MCP 200旋光測(cè)定儀（美國(guó)Anton Paar公司）；Agilent cary 600 FT-IR（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Milli-pore公司）；SC-2000 型血小板聚集測(cè)試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；Allegra X-30R型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

薄層色譜硅膠（GF254硅膠）、柱色譜硅膠（200～300目，H硅膠），青島海洋化工廠；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（瑞典Amershan Pharmacia公司）；色譜甲醇及乙腈（美國(guó)Sigma公司）；其他常規(guī)試劑均為成都市科隆化學(xué)品有限公司的分析純?cè)噭?；ADP（批號(hào)N0306A）及AA（批號(hào)J20713A）均購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司。

新西蘭兔，雄性，質(zhì)量2.2～2.5 kg，購(gòu)自成都達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，均符合3R原則。

1.3 藥材

蓬莪術(shù)藥材采于四川省崇州市三江鎮(zhèn)宋橋村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)高繼海副教授鑒定為蓬莪術(shù)Val.的干燥根莖，植物標(biāo)本（CP-20180303）保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

蓬莪術(shù)藥材（50 kg）粉碎后用95%乙醇回流提取3次，每次3 h，減壓濃縮后將浸膏分散于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取。將各部分萃取液濃縮，得到石油醚浸膏（1 kg）、醋酸乙酯浸膏（300 g）和正丁醇浸膏（500 g）。將醋酸乙酯浸膏用硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1～0∶1）和醋酸乙酯-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫得到11個(gè)洗脫部分（A～K）。其中D組分經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到4個(gè)流分（Fr. 1～4）。Fr. 2經(jīng)反向中壓液相色譜，甲醇-水（20∶80～0∶100）梯度洗脫，得到8個(gè)流分（Fr.2-1～2-8），其中Fr. 2-2經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜[二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）]梯度洗脫后，進(jìn)行反相半制備液相色譜分離，以40%甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，體積流量1.5 mL/min，分離得到化合物1（5 mg，R＝50 min）。Fr. 2-5經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫，得到6個(gè)流分（Fr.2-5-1～2-5-6）。其中Fr.2-5-1經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-丙酮（100∶1～1∶1）梯度洗脫后，以23%乙腈為流動(dòng)相，體積流量1 mL/min，進(jìn)行液相色譜分離（分析柱），得到化合物2（6 mg，R＝12.4 min）。Fr. 2-5-6經(jīng)高效液相色譜（分析柱），以30%乙腈水為流動(dòng)相，體積流量1 mL/min，分離得到化合物3（4.6 mg，R＝8.9 min）。

E組分經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到3個(gè)流分（Fr. 1～3），其中Fr. 2經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫得到7個(gè)流分（Fr. 2-1～2-7）。Fr. 2-3經(jīng)反相中壓液相色譜，以10%～100%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫得到10個(gè)流分（Fr. 2-3-1～2-3-10），其中Fr. 2-3-3經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜[石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）]等度洗脫后，再經(jīng)液相色譜（分析柱），以45%甲醇等度洗脫，體積流量1 mL/min，分離到到化合物6（10 mg，R＝6.2 min）。

F組分經(jīng)反相中壓液相色譜，以5%～100%甲醇梯度洗脫，得到19個(gè)流分（Fr. 1～19），其中Fr.8經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫得到7個(gè)流分（Fr. 8-1～8-7）。Fr. 8-6經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脫得到9個(gè)流分（Fr. 8-6-1～8-6-9），其中Fr. 8-6-6經(jīng)反相半制備液相色譜，以50%甲醇為流動(dòng)相，體積流量1.5 mL/min，分離得到化合物4（1.3 mg，R＝47 min）。外消旋混合物4經(jīng)Daicel Chiralpak AD-H柱，正己烷-乙醇（10∶1）進(jìn)行手性拆分，得到對(duì)映異構(gòu)體4a（0.5 mg，R＝13.9 min）和4b（0.4 mg，R＝15.0 min）。Fr. 9經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫得到3個(gè)流分（Fr. 9-1～9-3）。Fr. 9-1經(jīng)半制備薄層色譜[二氯甲烷-丙酮（20∶1）]分離后，再經(jīng)反相半制備液相色譜，以50%甲醇水洗脫，體積流量1.5 mL/min，分離到到化合物5（0.4 mg，R＝41 min）。

正丁醇萃取物經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（20%、50%、70%、95%）進(jìn)行梯度洗脫，回收溶劑得到4個(gè)流分（Fr. 1～4）。其中Fr.2經(jīng)反相中壓液相色譜，以30%～85%甲醇梯度洗脫得到12個(gè)流分（Fr. 2-1～2-12）。Fr. 2-2經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（200∶1～0∶1）梯度洗脫，得到10個(gè)流分（Fr. 2-2-1～2-2-10）。Fr. 2-2-3先后經(jīng)反相中壓液相色譜（20%～100%甲醇）和硅膠柱色譜[二氯甲烷-甲醇（100∶1～0∶1）]分離后，以35%甲醇為流動(dòng)相，體積流量1 mL/min，進(jìn)行反相半制備液相色譜分離，得到化合物7（0.6 mg，R＝63 min）。

2.2 化合物鑒定

為進(jìn)一步確定化合物1的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了2D NMR實(shí)驗(yàn)（圖2），通過(guò)化合物1的1H-1H COSY譜中相關(guān)信號(hào)以及HMBC譜中H3-14與C-1、C-9、C-10相關(guān)，OH-9與C-9、C-10相關(guān)，H-9與C-1、C-7、C-8、C-10相關(guān)，H3-15與C-3、C-4、C-5相關(guān)，H-5與C-3、C-6、C-7相關(guān)確證了C-1至C-10形成了4,10-二甲基-9-羥基-6-環(huán)癸酮。此外進(jìn)一步根據(jù)HMBC譜中H3-13與C-7、C-11、C-12相關(guān)以及H-12與C-7、C-8相關(guān)確定了結(jié)構(gòu)中C-7、C-8和C-11～C-13形成了11位甲基取代呋喃環(huán)。最后結(jié)合該化合物的不飽和度及連氧碳情況確定了化合物1的平面結(jié)構(gòu)如圖1所示。

在化合物1的NOESY譜中，H3-14與H-5、H-9相關(guān)，H-3與H-5相關(guān)，以及H3-15與H-1相關(guān)，表明H-1和H3-15位于同側(cè)，而與H-5、H-9和H3-14位于異側(cè)。進(jìn)一步，通過(guò)ECD與實(shí)驗(yàn)ECD譜對(duì)比的方法（圖3）確定了化合物1的絕對(duì)構(gòu)型。使用IEFPCM模型在甲醇中針對(duì)(1,4,5,9,10)-1和(1,4,5,9,10)-1在CAM-B3LYP/DGDZVP計(jì)算水平上計(jì)算得到的ECD譜如圖3所示。結(jié)果表明計(jì)算出的(1,4,5,9,10)-1 ECD譜與實(shí)驗(yàn)ECD譜吻合，因此化合物1確定為(1,4,5,9,10)-9-hydroxy- zederone epoxide，并命名為新蓬莪術(shù)環(huán)氧酮。

化合物2：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 249 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, acetone-6): 5.08 (1H, brs, H-8), 4.87 (1H, brs, H-1), 3.52 (1H, d,= 16.3 Hz, H-6a), 2.91 (1H, brs, H-9a), 2.55 (1H, brs, H-4), 2.29 (1H, m, H-2a), 2.00 (2H, m, H-2b, 3a), 1.95 (1H, m, H-9b), 1.88 (3H, s, H-15), 1.77 (3H, s, H-13), 1.75 (2H, overlapped, H-3b, 6b), 1.04 (3H, d,= 7.0 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, acetone-6): 209.4 (C-5), 173.8 (C-12), 157.8 (C-7), 133.8 (C-1), 130.7 (C-10), 128.5 (C-11), 80.4 (C-8), 48.3 (C-4), 47.4 (C-9), 42.3 (C-6), 36.7 (C-3), 27.9 (C-2), 18.8 (C-14), 16.0 (C-15), 9.3 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物2為curdionolide B。

表1 化合物1的1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù) (600/150MHz, acetone-d6)

圖2 化合物1的1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)信號(hào)

圖3 化合物1的實(shí)測(cè)和計(jì)算ECD譜圖

化合物3：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 265 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, acetone-6): 4.85 (1H, d,= 11.7 Hz, H-1), 3.61 (1H, d,= 15.8 Hz, H-6a), 3.51 (1H, d,= 15.8 Hz, H-6b), 2.87 (1H, d,= 13.2 Hz, H-9a), 2.56 (1H, m, H-4), 2.31 (1H, m, H-2a), 2.23 (1H, d,= 13.2 Hz, H-9b), 2.00 (2H, m, H-2b, H-3a), 1.96 (3H, s, H-15), 1.79 (3H, s, H-13), 1.69 (1H, m, H-3b), 1.02 (3H, d,= 6.9 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, acetone-6): 209.7 (C-5), 171.5 (C-12), 155.4 (C-7), 134.2 (C-1), 131.6 (C-10), 130.0 (C-11), 107.0 (C-8), 50.8 (C-9), 48.2 (C-4), 40.9 (C-6), 36.9 (C-3), 27.9 (C-2), 18.7 (C-14), 16.8 (C-15), 9.4 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物3為curdionolide A。

化合物4a和4b：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 262 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, acetone-6): 6.42 (1H, s, H-5), 4.95 (1H, m, H-1), 2.86 (1H, m, H-3a), 2.73 (1H, d,= 12.8 Hz, H-9a), 2.28 (1H, d,= 12.8 Hz, H-9b), 2.22 (1H, m, H-2a), 2.15 (1H, m, H-3b), 2.07 (1H, m, H-2b), 1.88 (6H, m, H-13, 14), 1.69 (3H, s, H-15)；13C-NMR (125 MHz, acetone-6) δ: 193.1 (C-6), 169.2 (C-12), 151.5 (C-7), 146.1 (C-4), 137.7 (C-10, 11), 129.9 (C-5), 127.1 (C-1), 91.1 (C-8), 49.6 (C-9), 29.6 (C-3), 25.6 (C-2), 24.1 (C-14), 17.7 (C-15), 9.1 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的 phaeocaulin A[13]基本一致?；衔?為外消旋混合物，經(jīng)手性高效液相色譜分離得到一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體4a和4b，其ECD數(shù)據(jù)分別為{ECD (MeCN)max(Δε) 236 (＋30.7), 293 (?18.0), 360 (＋2.2) nm; 4a}; {ECD (MeCN)max(Δε) 236(?30.4), 293 (+17.9), 360 (?2.1) nm; 4b}。通過(guò)與文獻(xiàn)中(＋)/(?)-phaeocaulin A[13]的ECD數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，最終確定化合物4a為(?)-phaeocaulin A，4b為(＋)-phaeocaulin A。

化合物5：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 269 [M ＋H]+。1H-NMR (600 MHz, acetone-6): 5.64 (1H, s, H-9), 4.33 (1H, m, H-1), 3.51 (1H, dd,= 13.2, 3.8 Hz, H-5), 2.88 (1H, t,= 13.2 Hz, H-6a), 2.64 (1H, dd,= 13.2, 3.8 Hz, H-6b), 2.32 (1H, m, H-2a), 2.09 (3H, s, H-13), 1.90 (3H, s, H-12), 1.86 (1H, m, H-2b), 1.76 (3H, s, H-15), 1.70 (1H, m, H-3a), 1.49 (1H, m, H-3b), 1.17 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, acetone-6): 198.1 (C-8), 145.5 (C-11), 144.9 (C-10), 132.6 (C-7), 128.4 (C-9), 83.3 (C-5), 74.1 (C-1), 69.3 (C-4), 32.7 (C-6), 29.0 (C-3), 27.6 (C-14), 23.6 (C-12, 13), 22.3 (C-15), 21.6 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物5為heyneanone C。

化合物6：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 251 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, acetone-6): 5.26 (1H, m, H-1), 4.26 (2H, m, H-13), 4.18 (1H, m, H-5), 1.87(3H, s, H-12), 1.71 (3H, s, H-15), 0.96 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, acetone-6): 204.0 (C-8), 138.2 (C-11), 135.6 (C-10), 130.6 (C-1), 127.2 (C-7), 64.8 (C-5), 62.6 (C-13), 60.7 (C-4), 55.6 (C-9), 38.3 (C-3), 29.5 (C-6), 25.2 (C-2), 18.4 (C-12), 17.2 (C-15), 16.2 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物6為(4,5)-13-hydroxygermacrone 4,5- epoxide。

化合物7：無(wú)色油狀物。ESI-MS/: 267 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.16 (1H, s, H-9), 3.20 (1H, dd,= 13.8, 6.3 Hz, H-5), 2.54 (1H, dd,= 12.7, 6.3 Hz, H-6a), 2.49 (1H, m, H-3a), 2.43 (1H, m, H-3b),2.20 (3H, s, H-15), 2.16 (2H, m, H-2), 2.05 (1H, dd,= 13.8, 12.7 Hz, H-6b), 1.31 (3H, s, H-12), 1.30 (3H, s, H-13), 1.26 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 166.7 (C-8), 160.8 (C-10), 126.7 (C-9), 120.9 (C-7), 96.6 (C-1), 74.5 (C-11), 71.8 (C-5), 71.3 (C-4), 48.0 (C-3), 32.5 (C-2), 29.3 (C-6), 25.0 (C-12, 14, 15), 23.4 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物6為phagermadiol。

在分離純化過(guò)程中，除化合物1～3、6外，其余化合物量較少，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物1～3、6進(jìn)行了抗血小板聚集活性篩選。

2.3 抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)[17]

家兔心臟取血，3.8%枸櫞酸三鈉溶液抗凝，血液與抗凝劑比例為9∶1，收集于離心管中，輕輕顛倒混勻。800 r/min離心10 min，取上清液，共離心2次，合并即得富血小板血漿（PRP）。下層血液以3500 r/min離心10 min，取上清液即為貧血小板血漿（PPP）。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組（100、50、25 μmol/L）及實(shí)驗(yàn)組（100、50、25 μmol/L），重復(fù)5次。取比濁管，分別加入290 μL PPP后，再分別加入各組對(duì)應(yīng)溶液10 μL，作為空白溶液。另取比濁管，各加入280 μL PRP，再分別加入各組對(duì)應(yīng)劑量溶液10 μL，作為相應(yīng)的待測(cè)溶液。血小板聚集儀預(yù)熱至37 ℃，以空白溶液調(diào)零后，換為對(duì)應(yīng)待測(cè)溶液，預(yù)熱60 s，加入ADP（10 μmol/L）或AA（0.5 mmol/L）10 μL誘導(dǎo)血小板聚集，測(cè)定各待測(cè)溶液組血小板聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率。

聚集抑制率=(對(duì)照組血小板聚集率－給藥組血小板聚集率)/對(duì)照組血小板聚集率

蓬莪術(shù)作為傳統(tǒng)活血化瘀中藥莪術(shù)的重要來(lái)源之一，具有抗血小板聚集、抗血栓等活性[18-19]，因此對(duì)分離得到的相應(yīng)單體化合物（1～3、6）進(jìn)行了抗血小板聚集活性篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 μmol/L陽(yáng)性藥阿司匹林對(duì)ADP及AA誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率分別為（44.83±1.24）%和（72.74±7.54）%，化合物1在100 μmol/L時(shí)對(duì)ADP及AA誘導(dǎo)的血小板聚集具有一定的抑制作用，抑制率分別為（21.07±8.67）%和（27.73±6.42）%，而其余3個(gè)化合物（2、3、6）在100 μmol/L時(shí)均無(wú)抑制作用。

3 討論

蓬莪術(shù)為傳統(tǒng)的川產(chǎn)活血化瘀中藥，藥用歷史悠久，對(duì)婦科疾病及心腦血管疾病具有顯著療效，且現(xiàn)代研究表明這些疾病均與活血化瘀功效密切相關(guān)。因此，進(jìn)行蓬莪術(shù)活血化瘀功效的現(xiàn)代研究具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義和社會(huì)價(jià)值。本研究采用現(xiàn)代分離手段和有機(jī)波譜學(xué)技術(shù)，共從蓬莪術(shù)中分離鑒定8個(gè)吉瑪烷型倍半萜，其中1為新化合物，并通過(guò)計(jì)算ECD確定了其絕對(duì)構(gòu)型?，F(xiàn)代研究表明莪術(shù)具有較好的抗血小板聚活性，而抑制血小板聚集的異常發(fā)生，對(duì)血栓栓塞性心血管疾病的防治具有重要意義[18-20]。因此，對(duì)分離所得化合物進(jìn)行了ADP及AA誘導(dǎo)的抗血小板聚集活性篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明，除化合物1在100 μmol/L時(shí)對(duì)ADP及AA誘導(dǎo)的血小板聚集具有一定抑制作用外，其余化合物（2、3、6）均無(wú)明顯抑制血小板聚集的作用?？梢?jiàn)，蓬莪術(shù)中吉瑪烷型倍半萜在抗血小板聚集方面活性欠佳，活性較強(qiáng)的成分有待進(jìn)一步探究。本研究豐富了蓬莪術(shù)倍半萜類化合物，且為后續(xù)繼續(xù)尋找與其活血功效相關(guān)的藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)和方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on germacrane-type sesquiterpenoids from

LI Xiao-cui1, 2, CHEN Jin-feng1, 2, XIONG Liang1,2, PENG Cheng1, GUO Li1, 2, LIU Fei1, 2

1. Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, School of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China 2. Institute of Innovative Medicine Ingredients of Southwest Specialty Medicinal Materials, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the chemical constituents and anti-platelet aggregative activities of germacrane-type sesquiterpenoids from the rhizome of.Ethyl acetate and-butanol fractions were separated and purificated by silica gel column, sephadex LH-20 column, reversed-phase medium pressure chromatography, preparative thin-layer chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography. The structures of isolates were determined by modern spectroscopy techniques, and the absolute configuration of new compound was identified by calculating ECD. The isolates were tested for their effects on ADP- and AA-induced platelet aggregation.Eight germacrane-type sesquiterpenoids were isolated from the rhizome of, and identified as neozederone epoxide (1), curdionolide B (2), curdionolide A (3), (?)-phaeocaulin A (4a), (+)-phaeocaulin A (4b), heyneanone C (5), (4,5)-13-hydroxygermacrone 4,5-epoxide (6), phagermadiol (7). The anti-platelet aggregation effects of compounds 1—3 and 6 were tested by suppressing ADP- and AA-induced platelet aggregation.Eight germacrane-type sesquiterpenoids were isolated from. Compound 1 is a new compound, and the absolute configuration of 1 is determined by calculating ECD, and compound 1 has a certain inhibitory effect on ADP- and AA-induced platelet aggregation. Compounds 4a and 4b are a pair of enantiomers. Furthermore, compounds 2, 3, 5 and 6 are isolated from the rhizome offor the first time.

Val.; germacrane-type sesquiterpenoids; ECD calculation; anti-platelet aggregative activity; neozederone epoxide

R284.1

A

0253 - 2670(2021)01 - 0028 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.005

2020-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81903777）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82022072）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2019M653362）；成都中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（BSH2018009）；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2017TD0001，2016TD0006）

李小翠（1994—），在讀碩士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: 1527407972@qq.com

劉 菲（1989—），博士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: feifeifly555@126.com

郭 力（1964—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: gli64@sina.com

[責(zé)任編輯 王文倩]