依托咪酯通過調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移

陳明明，李克寒，劉相樂，姚晶，馬慧穎

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000； 2.洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000)

鼻咽癌是最常見的頭頸部腫瘤之一，是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤。由于其區(qū)域分布和家族聚集，主要在中國(guó)南部和東南亞國(guó)家流行[1]。由于鼻咽區(qū)域中復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，在這種類型的癌癥中很少進(jìn)行手術(shù)，并且化學(xué)療法受到各種嚴(yán)重副作用的限制[2]。近年來癌癥治療手段取得不少進(jìn)步，但鼻咽癌患者的5年生存率仍然徘徊在50%～70%[3]。因此，迫切需要開發(fā)能夠治療鼻咽癌的新藥物。先前的研究表明，一些麻醉劑不僅通過阻斷圍手術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)，而且還通過誘導(dǎo)抗癌效應(yīng)來抑制癌癥轉(zhuǎn)移[4]。依托咪酯是一種催眠性靜脈全麻藥，是咪唑類衍生物，由于其安全性高，是麻醉誘導(dǎo)常用的藥物之一。已有研究表明，依托咪酯抑制A549肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[5]，但依托咪酯對(duì)鼻咽癌的作用尚不清楚。Hippo信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)節(jié)器官大小、組織再生和癌癥的關(guān)鍵信號(hào)通路，已有研究證明Hippo通路參與鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。本文主要研究依托咪酯通過調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

順鉑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號(hào)：PHR1624)，依托咪酯(HPLC≥99%，上海麥克林生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：33125-97-2)，RPMI-1640培養(yǎng)液(上海栩冉生物科技有限公司，批號(hào)：C22400500BT)，胎牛血清(素爾生物科技有限公司，批號(hào)：16000-044)，MTT試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：ZY111105)，RIPA裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰?，批號(hào)：SBJ-0999)，BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，批號(hào)：BC201)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、SGK3抗體、MST抗體、p-MST抗體、LAST抗體、p-LAST抗體、YAP抗體、p-YAP抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，批號(hào)： ab6728、ab126108、ab85377、ab79199、ab70561、ab111344、ab205270、ab76252),Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，批號(hào)：3422)，XMU-MP-1(Selleckchem，批號(hào)#S8334,)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下，于含有體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

在96孔板中，將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞分別用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)處理12 h、24 h、48 h時(shí)，再用10 μL MTT染料處理細(xì)胞，然后與100 μL二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測(cè)量吸光度。用各濃度處理組細(xì)胞吸光值與0 μmol/L組細(xì)胞的吸光度表示細(xì)胞活性。

1.4 分組及處理

將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞分別分為對(duì)照組、依托咪酯低劑量組、依托咪酯中劑量組、依托咪酯高劑量組、順鉑組、Hippo通路抑制劑(XMU-MP-1)組、依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組。對(duì)照組、依托咪酯低、中、高劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞用終濃度含有依托咪酯 0、10、20、40 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)；順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞用終濃度含有Cisplatin 10 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)；Hippo通路抑制劑組和依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1用終濃度含有XMU-MP-1 10 μg/mL和依托咪酯 0、40 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將各組轉(zhuǎn)染的鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔的密度接種在12孔板中，鋪滿單層后，用小號(hào)槍頭垂直在孔中間劃痕。在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。在劃痕0 h和24 h拍攝的圖像，使用ImageJ評(píng)估細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h時(shí)的劃痕面積-24 h時(shí)的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

在 Transwell 小室中鋪 40 μL matrigel 基質(zhì)膠，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中使其凝固，然后在Transwell小室上室接種鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，終濃度為 2.5×105個(gè)/mL，并在Transwell小室下室加入含血清和絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell 小室，用結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下觀察分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)p-MST、p-LATS、p-YAP、MST、LATS、YAP蛋白表達(dá)水平

在裂解緩沖液中提取總蛋白質(zhì)，并用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。將10 μg 蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜，然后用一抗(p-MST 1∶500、p-LATS 1∶500、p-YAP 1∶10 000、MST1∶100、LATS 1∶5000、YAP 1∶1000)在4 ℃封閉過夜，接著加入對(duì)應(yīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光)，然后再次用TBST洗滌3次。 使用ECL系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)合的抗體。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對(duì)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞存活率的影響

隨著依托咪酯濃度的增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞活性明顯下降；隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞活性逐漸下降。當(dāng)依托咪酯濃度為 5、10、20、40 μg/mL時(shí)，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞活性>80%，毒性較低。因此，本研究選擇依托咪酯10、20、40 μg/mL作后續(xù)研究。當(dāng)濃度相同時(shí)，24 h和48 h與12 h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而24 h 和48 h之間比較無明顯差異，因此，選擇藥物作用時(shí)間24 h作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2 依托咪酯對(duì)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移率無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移率有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移率明顯減少(P<0.01)。見圖2。

2.3 依托咪酯對(duì)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)。見圖3。

2.4 依托咪酯對(duì)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞Hippo信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)有所上調(diào)(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。見圖4。

A. MTT法檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活性； B. MTT法檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞活性。

A.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移; B.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞遷移; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞侵襲; B. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞侵襲; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.5 XMU-MP-1對(duì)依托咪酯激活Hippo信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；見圖5。

2.6 XMU-MP-1對(duì)依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移率明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞遷移率明顯增加(P<0.01)。見圖6。

2.7 XMU-MP-1對(duì)依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)。見圖7。

3 討論

鼻咽癌是最具侵襲性的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌之一，經(jīng)常轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)和器官。由于鼻咽癌致死率高，治療后生活質(zhì)量低，且鼻咽癌復(fù)發(fā)率高，所以該病的治療仍是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的臨床問題[7]。順鉑是一種鉑類抗腫瘤化療藥物，用于治療包括鼻咽癌在內(nèi)的多種實(shí)體惡性腫瘤。雖然具有較高的初始響應(yīng)性，但多數(shù)鼻咽癌患者不久就會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。麻醉劑可通過誘導(dǎo)抗癌效應(yīng)來抑制癌癥轉(zhuǎn)移[8]。依托咪酯減少心血管副作用并能夠維持麻醉期間的血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定性，是臨床上理想的鎮(zhèn)靜和麻醉藥。

A.蛋白印跡法檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平; B.蛋白印跡法檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A.蛋白印跡法檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平; B.蛋白印跡法檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移; B.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞遷移; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞侵襲; B. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌HNE-1細(xì)胞侵襲; 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

臨床發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用依托咪酯會(huì)引起免疫抑制作用以及增加細(xì)胞毒效應(yīng)的作用[9]。已有研究表明，依托咪酯可具有直接誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞體外凋亡的作用[10]，依托咪酯抑制A549肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[5]。因此，依托咪酯具有抗癌作用。鼻咽癌高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力密切相關(guān)，有效抑制人鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移可以抑制鼻咽癌的發(fā)展，如，蛇床子素可抑制CNE2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制EMT過程有關(guān)[11]；甲基蓮心堿通過抑制miR-423-5p的表達(dá)作用于下游靶基因SMIM3、NGF，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞的遷移侵襲，其與Hippo通路激活有關(guān)。

Hippo通路響應(yīng)多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，從細(xì)胞間的接觸和機(jī)械信號(hào)到G蛋白偶聯(lián)受體的配體和代謝通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號(hào)通路能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞分化，調(diào)控組織生長(zhǎng)的一個(gè)高度保守的生長(zhǎng)控制信號(hào)通路[13]。Hippo通路的核心包含一個(gè)核心激酶盒，該核心盒由一對(duì)相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶、MST1和MST2組成[14]。Hippo信號(hào)通路上游膜蛋白受體作為胞外生長(zhǎng)抑制信號(hào)的感受器，一旦感受到胞外生長(zhǎng)抑制信號(hào)，就會(huì)激活一系列激酶級(jí)聯(lián)磷酸化反應(yīng)，最終磷酸化下游效應(yīng)因子YAP和TAZ[15]。而細(xì)胞骨架蛋白會(huì)與磷酸化后的YAP和TAZ結(jié)合，使它滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并刺激它們的泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用，降低其細(xì)胞核活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控[16]。 本文研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯上調(diào)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞中p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)。當(dāng)Hippo通路被激活時(shí)，其功能相當(dāng)于腫瘤抑制因子。然而，這一途徑的失調(diào)有助于增加細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡和分化。因此，通過藥理學(xué)調(diào)節(jié)劑調(diào)控Hippo信號(hào)可能是一種有前途的抗癌策略[17]。Hippo通路具有獨(dú)特的致瘤能力，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突變和表達(dá)改變促進(jìn)了癌細(xì)胞的遷移、侵襲和惡性[18]。如，非受體酪氨酸磷酸酶14通過調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路YAP的磷酸化來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路參與鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]，低濃度佛手柑內(nèi)酯能顯著抑制鼻咽癌的腫瘤干細(xì)胞特性，其可能原因與激活腫瘤細(xì)胞中Hippo信號(hào)通路相關(guān)[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，添加Hippo通路抑制劑XMU-MP-1可下調(diào)p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達(dá)，促進(jìn)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞的遷移侵襲，同時(shí)逆轉(zhuǎn)依托咪酯對(duì)鼻咽癌CNE-1和HNE-1細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)依托咪酯通過調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移，因此，依托咪酯有望成為鼻咽癌治療的新藥物。本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的初步探討，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。