新型冠狀病毒核酸檢測模擬室內(nèi)質(zhì)控品的研制

楊傳坤，趙峰峰，吳國球,2，陳克平,2(.東南大學附屬中大醫(yī)院檢驗科，南京20009；2.東南大學醫(yī)學院檢驗系，南京20009)

新型冠狀病毒(2019-nCoV，簡稱新冠病毒)可引起新型冠狀病毒肺炎，此種病毒傳播性強、傳播迅速，且人群普遍易感[1]。早發(fā)現(xiàn)、早確診、早隔離是傳染病防控的關鍵，新冠病毒核酸檢測在疫情防控中扮演重要的角色[2]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的各版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，均將核酸檢測陽性作為新冠病毒感染確診金標準。截至目前，國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準了約20種采用實時熒光RT-PCR技術的新冠病毒核酸檢測試劑。此技術靈敏度高、操作簡便、成本較低，可在疾病早期或潛伏期內(nèi)識別微量的病毒顆粒[3]。受到疾病發(fā)展階段、樣本采集質(zhì)量、樣本運輸保存條件、試劑耗材質(zhì)量與操作人員水平等影響，核酸檢測結果會產(chǎn)生“假陰性”與“假陽性”[4-6]。鑒于此，各類新冠病毒核酸檢測實驗室操作規(guī)范與專家共識均建議進行室內(nèi)質(zhì)控，持續(xù)監(jiān)測核酸檢測質(zhì)量[7-9]。本研究利用國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心的噬菌體病毒樣顆粒樣本，制備了更接近臨床樣本基質(zhì)的新冠病毒模擬室內(nèi)質(zhì)控品，并初步評價其穩(wěn)定性。同時，本研究對目前市場在售的新冠病毒核酸檢測室內(nèi)質(zhì)控品進行分析總結，方便實驗室根據(jù)需要進行選擇，做好新冠病毒傳染防控的核酸檢測工作。

1 材料與方法

1.1樣本 新冠病毒核酸檢測質(zhì)控品原料[10]由國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心制備，2020年4月申請獲得。該原料為噬菌體病毒樣顆粒(假病毒)，包裝規(guī)格為0.5 mL/支，濃度為105～106copies/mL。低溫運輸，收到后放-80 ℃保存。

1.2儀器及試劑 BG-Flex-48全自動核酸提取儀(上海伯杰公司)，Anadas9850全自動核酸提取及熒光PCR分析系統(tǒng)(廈門安普利公司)；核酸提取及純化試劑、2019-nCoV核酸檢測試劑盒(上海伯杰公司)，PBS(上海生工公司)，RNase抑制劑(南京諾唯贊公司)。

1.3方法

1.3.1樣本處理 根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心推薦，用0.01 mol/L PBS對新冠病毒質(zhì)控品原料進行梯度稀釋，獲得1∶25、1∶125、1∶625稀釋的模擬質(zhì)控品。每支210 μL分裝至1.5 mL離心管中(NONPYROGENIC &RNase-free/DNase-free)。共獲得1∶25稀釋度模擬質(zhì)控品20支，1∶125稀釋度模擬質(zhì)控品30支，1∶625稀釋度模擬質(zhì)控品20支。同時，用新冠病毒核酸檢測陰性(Ct值>38)的口咽拭子臨床樣本混合液代替PBS稀釋該質(zhì)控品，使該質(zhì)控品獲得與臨床樣本類似的基質(zhì)，同樣獲得3個濃度梯度的模擬室內(nèi)質(zhì)控品。配制完成后取每個濃度的10支質(zhì)控品立即進行核酸檢測。剩余的1∶125稀釋度模擬質(zhì)控品中，10支加入RNA酶抑制劑，另10支不加入RNA酶抑制劑，然后均置于-20 ℃保存60 d，使用前平衡至室溫后立即進行檢測。

1.3.2核酸提取 取出預分裝提取試劑的96孔核酸提取板，在生物安全柜內(nèi)加入200 μL制備完成的模擬室內(nèi)質(zhì)控品，置于BG-Flex-48全自動核酸提取儀，加入磁套，選擇自動化提取程序啟動提取。提取獲得的核酸立即進行檢測。

1.3.3核酸擴增 按2019-nCoV核酸檢測試劑盒說明書配制25 μL反應體系，含核酸擴增反應液12 μL，酶混合液4 μL，ORF1ab/N反應液(主要為引物與探針)4 μL，核酸樣本5 μL。實時熒光RT-PCR擴增程序為：50 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s， 55 ℃ 40 s，40個循環(huán)。在Anadas9850全自動核酸提取及熒光PCR分析系統(tǒng)進行擴增，檢測新冠病毒ORF1ab及N靶基因。

1.3.4結果分析 根據(jù)實際擴增曲線調(diào)節(jié)起止值，進行分析，按上海伯杰試劑說明書中結果判讀標準判斷檢測結果，確定模擬質(zhì)控品靶基因ORF1ab及N的檢測循環(huán)閾值(Ct)值。

2 實驗與結果

2.1不同稀釋基質(zhì)對模擬質(zhì)控品靶基因檢測影響 用0.01 mol/L PBS與陰性臨床樣本梯度稀釋質(zhì)控品原料，得到3個濃度的模擬質(zhì)控品，實時熒光RT-PCR檢測結果顯示，3種濃度質(zhì)控品的N基因檢測Ct值大于ORF1ab基因(約小3個Ct值)。當質(zhì)控品進行1∶25和1∶125稀釋時，PBS與陰性臨床樣本梯度稀釋質(zhì)控品間ORF1ab和N靶基因檢測Ct值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而當質(zhì)控品進行1∶625稀釋時，PBS與陰性臨床樣本梯度稀釋質(zhì)控品間ORF1ab和N靶基因檢測Ct值差異有統(tǒng)計學意義，且陰性臨床樣本稀釋效果優(yōu)于PBS稀釋。見表1。

表1 PBS與陰性樣本梯度稀釋質(zhì)控品的靶基因檢測Ct值

2.2模擬室內(nèi)質(zhì)控品穩(wěn)定性評價 選擇1∶125稀釋制備的質(zhì)控品(接近新冠病毒核酸檢測試劑檢測下限103copies/mL)評價其穩(wěn)定性。將最初配制的此濃度質(zhì)控品分成2組，其中一組加入RNase抑制劑，另一組不加任何物質(zhì)，兩組均放入-20 ℃冰箱保存。60 d后取出模擬質(zhì)控品室溫融化后立即進行檢測。以未凍存質(zhì)控品檢測結果作為基礎數(shù)據(jù)。結果表明，凍存前后ORF1ab基因與N基因的檢測Ct值差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。未添加RNase抑制劑的模擬室內(nèi)質(zhì)控品未發(fā)生顯著降解。見表2。

表2 模擬室內(nèi)質(zhì)控品的60 d穩(wěn)定性評價

3 討論

新冠病毒核酸檢測試劑是在疫情暴發(fā)情況下研發(fā)的臨床檢測試劑，大部分廠家無法獲得大量臨床樣本進行檢測試劑的性能驗證。因此，進行嚴格的質(zhì)量控制是非常必要的。本實驗室相繼參加上海臨檢中心(2020年2月)、國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心(2020年3月)和江蘇省臨檢中心(2020年6月)組織的新冠病毒核酸檢測室間質(zhì)評活動。同時，在疫情早期市場無可售相應室內(nèi)質(zhì)控品的情況下，本實驗室從國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心申請到噬菌體病毒樣顆粒質(zhì)控品原料進行室內(nèi)質(zhì)控。臨檢中心推薦使用PBS配制室內(nèi)質(zhì)控品，但無法反映基質(zhì)效應。因此，本研究利用陰性臨床樣本作為稀釋液配制梯度濃度的室內(nèi)質(zhì)控品，并且對這種模擬質(zhì)控品進行初步評價。

本研究發(fā)現(xiàn)，用PBS和陰性樣本稀釋質(zhì)控品原料，1∶25和1∶125稀釋時，ORF1ab和N靶基因檢測Ct值差異無統(tǒng)計學意義，而1∶625稀釋時，ORF1ab和N靶基因檢測Ct值差異有統(tǒng)計學意義。質(zhì)控品原料初始濃度為105～106copies/mL，1∶625稀釋后濃度約為160～1 600 copies/mL，而上海伯杰公司新冠核酸檢測試劑最低檢測限為1 000 copies/mL。因此，此稀釋倍數(shù)制備的模擬室內(nèi)質(zhì)控品濃度在試劑檢測限附近，檢測得到的Ct值是不穩(wěn)定的。同時，陰性樣本作為稀釋基質(zhì)制備的模擬質(zhì)控品成分復雜，這些因素造成Ct值的標準差與CV值均大于PBS 作為稀釋基質(zhì)時的標準差與CV值。但陰性樣本稀釋優(yōu)于PBS，Ct值小，檢測靈敏度更高。因此，本研究使用試劑檢測下限2～5倍的濃度，即1∶125稀釋得到的模擬室內(nèi)質(zhì)控品評價其穩(wěn)定性。綜上所述，本研究使用陰性臨床樣本作為基質(zhì)制備模擬質(zhì)控品是可行的；與PBS相比，陰性樣本稀釋制備的質(zhì)控品可更好反映基質(zhì)效應程度，檢測靈敏度甚至更好，但需要更深入的研究。

同時，3個濃度水平的模擬質(zhì)控品N靶基因檢測Ct值均大于ORF1ab，即2個靶基因的檢出率存在差別。其他研究者用熒光RT-PCR檢測新冠病毒也發(fā)現(xiàn)N基因的陽性率高于ORF1ab基因[5]。Chu等[11]將研發(fā)的新冠核酸檢測試劑檢測臨床陽性樣本，發(fā)現(xiàn)N基因的靈敏度比ORF1ab基因高10倍。這可能由于被感染細胞中的新冠病毒mRNA數(shù)倍于基因組RNA，且新冠病毒不斷轉錄新mRNA，這些mRNA均帶有N基因，而僅帶有少量ORF1ab基因，因此N基因陽性率高于ORF1ab基因[12]。這種檢出率差異也可能由于檢測試劑對靶基因的檢測靈敏度不同，以及N基因固有的保守性不如ORF1ab造成的核酸序列交叉，造成N基因檢測假陽性[5，12]。本研究使用的質(zhì)控品非臨床樣本，N基因和ORF1ab基因檢測Ct值差異應該由檢測試劑對靶基因的檢測靈敏度不同而造成。因此，在進行新冠核酸檢測時，應關注單靶基因陽性的臨床樣本，結果判斷應結合試劑盒的靶基因檢測靈敏度和患者臨床癥狀，避免弱陽性樣本的漏檢。

制備的模擬質(zhì)控品可以保存60 d未發(fā)生顯著降解，并且未加RNase抑制劑的模擬質(zhì)控品穩(wěn)定性不受顯著影響。本研究制備模擬質(zhì)控品后即凍存，使用時室溫融化后立即檢測。否則，考慮到陰性樣本成分的復雜性，液態(tài)長期保存應該會影響質(zhì)控品穩(wěn)定性。但本研究使用的-20 ℃凍存條件一般實驗室均具備，因此具有可操作性。

目前，廣州邦德盛、北京康徹思坦與鄭州標源等生物公司研發(fā)、在售新冠病毒核酸檢測的室內(nèi)質(zhì)控品，均以假病毒為原料制備。這些質(zhì)控品價格昂貴，其室內(nèi)質(zhì)量的監(jiān)控作用待市場反饋。本研究使用陰性樣本稀釋制備的模擬質(zhì)控品更接近臨床樣本基質(zhì)，可保持靶基因檢測靈敏度，可長期穩(wěn)定保存。新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點推薦試劑盒陽性質(zhì)控品(陽性對照)使用假病毒作為原料[13]，與本研究使用原料相同。在市售新冠病毒核酸檢測室內(nèi)質(zhì)控品選擇有限且價格昂貴，陽性臨床樣本難以獲得的情況下，根據(jù)本研究利用陰性樣本稀釋試劑盒陽性對照制備模擬室內(nèi)質(zhì)控品，方法簡單，成本低廉，可大量獲得，可有效監(jiān)測新冠病毒核酸檢測質(zhì)量。