過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑的性能驗證

杜文勝，朱杰華，潘麗，黎兵，何應(yīng)中，陳莉，黃俊瓊(. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州遵義 563003；. 玉溪市人民醫(yī)院檢驗科，云南玉溪 65300)

臨床常見的過敏性疾病以Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)為主，即由IgE抗體所介導(dǎo)，多表現(xiàn)為過敏性鼻炎、特異性皮炎、過敏性哮喘等癥狀，發(fā)病率逐年上升[1-2]。過敏原IgE抗體檢測對于反映病情、協(xié)助診斷、預(yù)測疾病的發(fā)生和預(yù)后具有重要作用，已被納入多項過敏性疾病的臨床診療指南[3-7]，其試劑的性能直接影響過敏性疾病的臨床診療，定量檢測數(shù)據(jù)有助于減少實驗室偏差[8]。國內(nèi)臨床檢驗領(lǐng)域尚缺乏過敏原試劑定量檢測試劑性能驗證的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究對一種國產(chǎn)過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒進行性能驗證，參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(clinical and laboratory standards institute, CLSI)2016年文件(I/LA 20, 3rd ed. October 2016)[9]及中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1581-2018[10]進行，驗證指標(biāo)覆蓋試劑說明書描述的性能指標(biāo)。同時，對6個重點項目(屋塵螨、粉塵螨、屋塵、艾蒿、雞蛋、牛奶)與ImmunoCAP系統(tǒng)的定性與定量一致性進行比較，數(shù)據(jù)匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料與方法

1.1臨床樣本 驗證試驗樣本取自遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2019年1月1日至2020年1月1日門診患者的臨床常規(guī)檢測剩余血清，所有樣本排除溶血、脂血，并免除知情同意。其中，特異性驗證樣本4份，分別為總IgE濃度>60 IU/mL且特異性IgE為陰性的樣本、IgA濃度>700 μg/mL的樣本、IgM濃度>500 μg/mL的樣本、IgG 濃度>7 000 μg/mL的樣本；一致性比較樣本639份，均用江蘇浩歐博公司試劑檢測過敏原IgE抗體，過敏原為屋塵螨150例(陽性99例，陰性51例)，粉塵螨150例(陽性98例，陰性52例)，屋塵75例(陽性35例，陰性40例)，艾蒿65例(陽性36例，陰性29例)，雞蛋105例(陽性77例，陰性32例)，牛奶共94例(陽性61例，陰性33例)。根據(jù)過敏原診斷試劑國際分級標(biāo)準(zhǔn)進行特異性IgE分級：0.35 U/mL≤1級<0.7 U/mL，0.7 U/mL≤2級<3.5 U/mL，3.5 U/mL≤3級<17.5 U/mL，17.5 U/mL≤4級<50 U/mL，50 U/mL≤5級<100 U/mL為5級，≥100 U/mL為6級。

1.2儀器與試劑 URANUS AE-95型全自動酶免儀(深圳愛康公司)，Phadia 250全自動體外熒光免疫分析系統(tǒng)(瑞典Phadia AB公司)；待驗證試劑：符博克TM過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑(免疫捕獲法，過敏原共21項：總IgE、屋塵螨、粉塵螨、艾蒿、普通豚草、蟑螂、貓上皮、狗上皮、屋塵、交鏈孢霉、柳樹、花生、雞蛋、牛奶、鱈魚、小麥面粉、蝦、大豆、蟹、牛肉、羊肉，江蘇浩歐博公司)；比對試劑： ImmunoCAP特異性IgE定量檢測試劑(瑞典Phadia AB公司)；參考物質(zhì)：血清IgE的第3代國際標(biāo)準(zhǔn)品WHO 11/234(英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所，相對偏差試驗用)。

1.3方法

1.3.3檢出限 (1)行標(biāo)推薦做法:選擇6個過敏原(屋塵螨、粉塵螨、屋塵、艾蒿、牛奶、雞蛋)特異性抗體項目進行檢測。對5份濃度近似試劑說明書中聲稱的檢出限0.35 IU/mL(濃度值介于0.30～0.35 IU/mL，吸光度范圍0.050～0.085)的樣本進行檢測，每份樣本檢測5次，共計25次，對檢測值進行統(tǒng)計。

1.3.4線性 選擇6個過敏原(屋塵螨、粉塵螨、屋塵、艾蒿、牛奶、雞蛋)特異性抗體項目進行檢測。用體檢血清樣本(6項檢測結(jié)果均為陰性)稀釋接近試劑說明書中聲稱的線性區(qū)間上限的高濃度樣本(80～100 IU/mL以內(nèi))，混合成5個稀釋濃度(Xi)，用待驗證試劑分別檢測以上樣本，每個稀釋濃度檢測3次，分別求出每個稀釋濃度檢測結(jié)果的均值(Yi)。以稀釋濃度(Xi)為自變量，檢測結(jié)果均值(Yi)為因變量，繪制散點圖，以最小二乘法進行線性擬合，求出線性回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)(r)。

1.3.5特異性 用URANUS AE-95型全自動酶免儀操作，對20個項目用總IgE濃度>60 IU/mL且特異性IgE為陰性的樣本、IgA濃度>700 μg/mL的樣本、IgM濃度>500 μg/mL的樣本、IgG濃度>7 000 μg/mL的樣本進行檢測，對測定結(jié)果進行統(tǒng)計。

1.3.6一致性比較 重點考察待驗證試劑與ImmunoCAP試劑在屋塵螨(D1)、粉塵螨(D2)、屋塵(H1)、艾蒿(W6)、牛奶(F2)、雞蛋(F252)6個項目中的一致性，其余項目因陽性樣本過少不構(gòu)成統(tǒng)計學(xué)意義而未納入比對研究。所有一致性比較樣本全部送貴陽金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司用Phadia 250全自動體外熒光免疫分析系統(tǒng)進行平行檢測，按其試劑盒說明書進行操作。計算2種方法檢測結(jié)果的定性一致性(陰陽性符合率、總符合率、Kappa系數(shù))和定量相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1精密度

2.1.1重復(fù)性 20種過敏原特異性IgE抗體2個濃度的CV均<10%，低于試劑說明書要求的不精密度(<15%)，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求中重復(fù)性的CV儀器操作應(yīng)≤10%的要求。見表1。

表1 20種過敏原項目的精密度

2.1.2批間不精密度 6個重點項目(屋塵螨、粉塵螨、屋塵、艾蒿、牛奶、雞蛋)使用3個批號試劑盒(20190909、20191012、20191113)進行檢測，批間CV均<20%。其中低濃度樣本(濃度值介于0.51～0.71 IU/mL)6個項目的CV依次為13.82%、13.10%、13.33%、9.61%、15.27%、19.64%；高濃度樣本(濃度值介于7.22～17.36 IU/mL)6個項目的CV依次為17.40%、6.86%、9.56%、13.19%、11.10%、12.43%。均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求(≤20%)。

2.2準(zhǔn)確度

2.2.1準(zhǔn)確度——相對偏差試驗 對定值濃度為5 IU/mL、50 IU/mL、500 IU/mL的WHO 11/234低、中、高3個濃度的樣本用待驗證試劑進行總IgE項目檢測，重復(fù)3次，每次的Bi均在±15%以內(nèi)，符合要求，見表2。

表2 WHO IgE參考物質(zhì)相對偏差試驗結(jié)果

2.2.2準(zhǔn)確度——添加回收試驗 對20個過敏原項目進行添加回收試驗，回收率均在85%～115%之間，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，見表3。

表3 20種過敏原項目添加回收試驗結(jié)果

2.3檢出限

2.3.1檢出限——行標(biāo)方法 對6個項目各25次檢測結(jié)果進行統(tǒng)計。對屋塵螨、粉塵螨、屋塵3個項目，25次中分別都有2次檢測值超過參考區(qū)間下限(0.35 IU/mL)，未能符合行標(biāo)要求；而艾蒿、雞蛋、牛奶25次中均沒有高于參考區(qū)間下限(0.35 IU/mL)的檢測結(jié)果，符合行標(biāo)要求，故該性能指標(biāo)部分通過。

2.3.2檢出限——CLSI方法 6種過敏原的LOB均在0.10 IU/mL以內(nèi)，LOD均在0.20 IU/mL以內(nèi)，不高于說明書聲明的0.35 IU/mL，符合要求，見表4。

表4 6種過敏原項目的檢出限結(jié)果(CLSI方法)

2.4線性 6種過敏原項目均有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.990，符合要求，見表5。

表5 6種過敏原特異性IgE抗體的線性關(guān)系

2.5特異性 對20個項目使用總IgE>60 IU/mL、IgA>700 μg/mL、IgM>500 μg/mL、IgG>7 000 μg/mL多種干擾物質(zhì)樣本進行檢測，測定結(jié)果均不高于檢出限(0.35 IU/mL)，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.6一致性比較 6個過敏原項目與ImmunoCAP方法學(xué)比對的陰陽性符合率、Kappa值見表6，Kappa值均>0.75，說明2種方法學(xué)具有較好的一致性。

表6 6種過敏原項目的一致性比較結(jié)果

3 討論

過敏原特異性IgE的臨床檢測分為定性和定量2種，目前國內(nèi)使用的試劑仍以定性為主，遠(yuǎn)落后于國外。近年來定量檢測正逐漸成為一種趨勢[8]。本研究對該定量試劑的準(zhǔn)確度進行檢測，使用WHO IgE標(biāo)準(zhǔn)品對總IgE項目進行檢測，低、中、高3個濃度的偏差均在15%以內(nèi)，其中中濃度的偏差最小，在5%以內(nèi)，低濃度和高濃度偏差稍大，有個別超過10%，可能與該系統(tǒng)采用的方法學(xué)有關(guān)。酶聯(lián)免疫捕獲法是ELISA的改進，使用的仍然是聚苯乙烯固相載體和四甲基聯(lián)苯胺底物[11]，由于線性范圍受限，標(biāo)準(zhǔn)曲線在低端和高端受到壓縮，當(dāng)吸光度值稍有波動時，就會對標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合換算后濃度產(chǎn)生較大影響，因此低端和高端波動稍大。在準(zhǔn)確度的添加回收實驗結(jié)果中，20項過敏原的回收率均在85%～115%之間，滿足標(biāo)準(zhǔn)，說明回收率較高，準(zhǔn)確度驗證通過。

本研究驗證的“檢出限、線性、批間差、一致性比較”項目由于需要較大樣本體積和高值過敏原陽性樣本，本院僅收集獲得6個常見項目的陽性樣本可以滿足需求，因此未能全部驗證。在檢出限實驗中，2018年行標(biāo)與2016年美國CLSI操作方法有較大的不同，因此2種驗證方法均進行驗證。行標(biāo)要求使用的5份濃度近似檢出限(0.35 IU/mL)的低值樣本，均通過陽性血清樣本稀釋獲得，屋塵螨、粉塵螨、屋塵3個項目分別都有1個樣本的2次檢測數(shù)值超過參考區(qū)間下限(0.35 IU/mL)，未能符合行標(biāo)要求，可能原因是這些樣本稀釋后得到的濃度過于接近臨界值，因而稍有波動就會高于檢出限。而使用CLSI推薦方法驗證后，LOB均<0.10 IU/mL，LOD均<0.35 IU/mL，滿足說明書標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。由于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中“濃度近似檢出限樣本”的概念過于模糊，樣本配制的主觀影響因素大，因此CLSI方案更適合用于檢出限的性能驗證。另外，該系統(tǒng)的重復(fù)性<10%、批間差<20%、線性r>0.99，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，驗證通過。

在一致性比較中，對該系統(tǒng)和ImmunoCAP系統(tǒng)進行了6個項目的比對驗證。ImmunoCAP系統(tǒng)被歐洲過敏反應(yīng)與臨床免疫學(xué)會視為體外診斷過敏性疾病的“參考方法”[12]，該法在國際上應(yīng)用最為廣泛，可實現(xiàn)全自動逐項定量檢測單種過敏原，敏感性、特異性均較佳。但由于每檢測一項過敏原約需耗費1～2 μg的過敏原原料，導(dǎo)致成本和收費高昂、使用客戶有限[13]。6個項目Kappa系數(shù)均>0.75，說明2種方法學(xué)在定性結(jié)果上一致性較好，符合國家ISO15189標(biāo)準(zhǔn)；屋塵螨、粉塵螨、屋塵、艾蒿項目Kappa值均>0.80，說明定性結(jié)果幾乎完全一致，而牛奶和雞蛋項目的Kappa系數(shù)<0.80，則在定性結(jié)果上差異稍大。從量值結(jié)果來看，屋塵螨、粉塵螨、屋塵、牛奶4個項目量值相關(guān)系數(shù)r均>0.9，說明量值具有很高的相關(guān)性，而雞蛋和艾蒿項目r<0.9，量值相關(guān)性稍差。過敏原原材料是決定過敏原檢測結(jié)果的重要因素[14]，原料成分復(fù)雜，每種過敏原的致敏組分均不止一種，不同生物物種亞型不同，也使得原材料產(chǎn)生差異[15]。有些過敏原若使用天然過敏原提取物，可能會缺少過敏原組分或僅存在少量過敏組分而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，試劑會通過向過敏原提取物內(nèi)摻加少量過敏組分來解決此問題[13]。該國產(chǎn)檢測試劑大多數(shù)原料來源于國內(nèi)及自主研發(fā)，而ImmunoCAP系統(tǒng)的試劑原料主要來自瑞典，不同地域的物種來源可能存在差異，這或許是艾蒿項目量值一致性稍差的原因；另一方面，雞蛋項目一致性稍差的原因是該試劑檢測的是全蛋(包括蛋清和蛋黃)，而ImmunoCAP系統(tǒng)檢測的是蛋白(僅蛋清)，因此陰性符合率較低，不排除是蛋黃致敏的可能。雞蛋分為雞蛋黃和雞蛋白，蛋黃中過敏原種類相對較少，最主要為α-卵黃蛋白(Gal d 5)，而雞蛋白含有20多種過敏原，致敏能力最強的是卵粘蛋白(OVM, Gal d 1)，蛋白是雞蛋過敏的主要致敏物質(zhì)[16]。牛奶過敏原也含有多種致敏組分，主要致敏組分是酪蛋白(αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白)和乳清蛋白(α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)[15]，不同廠家的原材料中各種致敏組分配比不同也影響最終的檢測結(jié)果及定量數(shù)值，這是2種方法學(xué)牛奶項目也存在差異的原因。

本研究不足之處在于，未能獲得全部過敏原的陽性樣本，部分性能驗證項目僅針對6種過敏原進行驗證。但與先前類似文章相比[16]，本研究驗證維度更全面，所依據(jù)的方法標(biāo)準(zhǔn)更新，對檢出限的驗證首次采用2種方式進行。免疫捕獲法應(yīng)用于過敏原檢測的優(yōu)勢在于所有微孔板包被物相同，可實現(xiàn)不同過敏原項目靈活組合，滿足過敏原套餐自由定制需求和醫(yī)保改革的大趨勢，有一定的臨床推廣價值。