Cu2+、Zn2+脅迫下苦草的生理生化特性研究

江 延 王 巖 賈雨淅 李睿江楊婉秋 姚軍文 高桂青

(1.南昌工程學(xué)院 土木與建筑工程學(xué)院，江西 南昌 330099；2.南昌工程學(xué)院 水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西 南昌 330099)

由于礦產(chǎn)資源的不合理開(kāi)發(fā)利用和人類生活中的胡亂排放，大量重金屬元素進(jìn)入河流湖泊當(dāng)中[1-3]，使得水體重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)[4]。重金屬種類和來(lái)源各不相同，導(dǎo)致水體污染情況十分復(fù)雜[5-6]，因此重金屬污染水體的污染情況也普遍以復(fù)合脅迫的形式出現(xiàn)，其中，Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+等都是較為常見(jiàn)的重金屬污染物[7]。研究表明：重金屬對(duì)植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡起到極其關(guān)鍵的作用[8-9]。植物短期內(nèi)能夠抵抗低濃度的重金屬脅迫，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和重金屬濃度的升高，其生理生長(zhǎng)會(huì)被嚴(yán)重遏制[10]。

苦草是我國(guó)大多湖泊的優(yōu)勢(shì)物種，由于其生長(zhǎng)繁殖較快、分布較廣，對(duì)多種重金屬的富集效果較高，逐漸成為解決重金屬污染問(wèn)題的先鋒物種[11]。Cu2+、Zn2+都是苦草生長(zhǎng)的微量元素，低濃度下能夠促進(jìn)其發(fā)育生長(zhǎng)，但高濃度的Cu2+、Zn2+會(huì)影響到苦草對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，打破細(xì)胞新陳代謝的平衡[12]，進(jìn)而引發(fā)一系列的生理狀況，對(duì)苦草的健康狀況產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。本研究通過(guò)Cu2+、Zn2+脅迫下苦草的生理生化特性，探討其響應(yīng)過(guò)程，以期為重金屬污染水體的生態(tài)修復(fù)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需的苦草和底泥均采自鄱陽(yáng)湖。將底泥剔除雜物后，均勻地平鋪在塑料方盒(長(zhǎng)34.0 cm、寬22.5 cm、高10 cm)中，底泥厚8 cm。選取葉片健康、長(zhǎng)勢(shì)健壯的苦草植株，修剪葉片長(zhǎng)度為15 cm，根長(zhǎng)為3 cm，洗去葉片表面附著物后均勻種植在塑料盒中，每盒12株，然后將塑料方盒放入玻璃缸(長(zhǎng)40 cm、寬40 cm、高50 cm)內(nèi)，加入經(jīng)過(guò)晾曬的自來(lái)水至40 cm高度處進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)[13]，待植株生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定后用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

向玻璃缸中加入不同濃度的CuSO4、ZnSO4溶液分別進(jìn)行單一及復(fù)合脅迫處理，各設(shè)置5個(gè)處理組(T1、T2、T3、T4、T5)。Cu2+濃度梯度依次為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，Zn2+濃度梯度依次為2.0mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L和10.0 mg/L，Cu2++Zn2+復(fù)合處理濃度依次為(0.1+1.0)mg/L、(0.2+2.0)mg/L、(0.3+3.0)mg/L、(0.4+4.0)mg/L和(0.5+5.0)mg/L，與此同時(shí)，設(shè)置濃度為0mg/L的空白對(duì)照組(CK)，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。脅迫培養(yǎng)14d后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

采用氮藍(lán)四唑比色法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)；采用測(cè)定過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)；采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛(Malondialdehyde，MDA)；采用分光光度法測(cè)定光合色素。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次以上平行數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的處理和制圖釆用Excel2017，用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用SNK法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+、Zn2+不同脅迫對(duì)苦草SOD的影響

Cu2+和Zn2+作為有毒重金屬，對(duì)苦草的生理狀況產(chǎn)生了一定的影響。由圖1所知，脅迫培養(yǎng)14d，三種處理方式的T1處理組均小于對(duì)照組，當(dāng)Cu2+濃度為0.2mg/L時(shí)，SOD值最低。Zn2+處理下的苦草SOD值始終呈顯著上升趨勢(shì)，T5處理組達(dá)到最大，對(duì)比對(duì)照組上升了67.15%，Cu2+單一脅迫的最大值出現(xiàn)在T4處理組為47.35，T5處理組處又呈現(xiàn)明顯的降低現(xiàn)象，說(shuō)明此濃度的重金屬脅迫已經(jīng)超出了苦草的承受范圍，對(duì)苦草的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制性，所以出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。

圖1 不同濃度重金屬脅迫對(duì)苦草SOD的影響

Cu2+和Zn2+單一及復(fù)合脅迫引起的苦草SOD變化表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。整體上看，復(fù)合脅迫造成的變化程度更大，且復(fù)合脅迫與Cu2+單一脅迫產(chǎn)生的變化規(guī)律具有一定的相似性，最大值出現(xiàn)在T4處理組中。T1處理組SOD值與兩種重金屬單一脅迫相差不大，但在較高的濃度中發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫引起的變化幅度最大，其次是復(fù)合脅迫，Zn2+脅迫最小。T5階段SOD值降至最低，甚至小于對(duì)照組。三種處理方式對(duì)苦草的抑制性表現(xiàn)為：Cu2+脅迫>復(fù)合脅迫>Zn2+脅迫。

2.2 Cu2+、Zn2+不同脅迫對(duì)苦草POD的影響

如圖2所示，Cu2+和Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)苦草POD活性產(chǎn)生顯著的影響(P<0.05)。T1處理組中，三種處理方式的POD值均低于CK組，且酶活性相差不大。隨著重金屬脅迫濃度的升高，Cu2+和Zn2+單一及復(fù)合脅迫的POD活性變化趨勢(shì)基本相同，T1至T5處理組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且均在T4處理階段達(dá)到最大，分別為30.47、29.98和36.23，而后又出現(xiàn)不同程度的下降，說(shuō)明T5處理組的重金屬濃度過(guò)高，已經(jīng)對(duì)苦草POD活性產(chǎn)生了抑制作用。

圖2 不同濃度重金屬脅迫對(duì)苦草POD的影響

整體上來(lái)，兩種重金屬單一脅迫造成的變化相差不大，說(shuō)明單因素的Cu2+和Zn2+對(duì)苦草POD的影響基本相同。復(fù)合脅迫的變化幅度較兩種單一脅迫更大，說(shuō)明對(duì)苦草的抑制性最高。

2.3 Cu2+、Zn2+不同脅迫對(duì)苦草MDA的影響

苦草MDA含量對(duì)Cu2+和Zn2+單一及復(fù)合脅迫響應(yīng)如圖3所示：三種處理的最小值均出現(xiàn)在T1處理組，分別為7.11、6.97和7.01。Cu2+和Zn2+單一脅迫下始終隨濃度的升高而顯著增大(P<0.05)，且兩種處理的變化幅度相差不大，最大值分別為23.67和22.79。

圖3 不同濃度重金屬脅迫對(duì)苦草MDA的影響

復(fù)合脅迫下的MDA含量隨脅迫濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，T4處理組達(dá)到最大，較CK組上升了184.60%，T5處理中又顯著降低，其MDA含量為15.69。三種處理中，復(fù)合脅迫對(duì)苦草的抑制性最強(qiáng)。

2.4 Cu2+、Zn2+不同脅迫對(duì)苦草葉片光合色素含量的影響

葉綠素含量與植物光合作用的能力關(guān)系緊密，植物體通過(guò)光合作用將體內(nèi)有機(jī)物轉(zhuǎn)化為能量，太陽(yáng)光為葉綠素供能將CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物[14]。本小節(jié)從葉綠素含量變化的角度來(lái)說(shuō)明苦草在重金屬脅迫的影響。

三種處理方式的T1處理組葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b均有所增大，可能是由于Cu2+、Zn2+都是苦草生長(zhǎng)所需的微量元素，在一定程度上能夠刺激葉綠素的合成，但三種處理的增幅相差不大。隨著重金屬脅迫濃度的升高，葉綠素a+b、葉綠素a含量顯著下降(P<0.05)，而葉綠素b含量變化不顯著。脅迫14d，T5處理組的葉綠素b均達(dá)到最低，Cu2+脅迫下分別為對(duì)照組的69.94%、58.81%、90.06%；Zn2+處理分別為對(duì)照組的67.55%、61.26%、78.92%；復(fù)合脅迫的葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b分別為對(duì)照組的42.43%、30.99%、63.11%。Cu2+、Zn2+復(fù)合脅迫的變化幅度比單一脅迫更大，對(duì)苦草葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的抑制性表現(xiàn)為：復(fù)合脅迫>Zn2+脅迫>Cu2+脅迫。

T1到T5階段，隨著Cu2+、Zn2+和復(fù)合脅迫濃度的增大，葉綠素a/b呈持續(xù)下降趨勢(shì)，其最小值分別為對(duì)照組的65.30%、77.15%、48.24%，說(shuō)明復(fù)合脅迫的降低程度大于單一脅迫，對(duì)葉綠素a/b的抑制性表現(xiàn)為：復(fù)合脅迫>Cu2+脅迫>Zn2+脅迫。

表1 不同濃度Cu2+、Zn2+處理對(duì)苦草光合色素指標(biāo)的響應(yīng)

3 討論

目前，關(guān)于植物抗氧化酶活性的研究很多。SOD、POD、MDA是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)維護(hù)植物保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用[15]。當(dāng)植物受到外界條件干擾時(shí)，酶活性平衡被破壞，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的O2-、H2O2、OH，然后進(jìn)一步加快膜脂過(guò)氧化進(jìn)程，降低植物體的膜系統(tǒng)完整性[16]。研究表明：外界環(huán)境的脅迫會(huì)造成植物體電解質(zhì)和小分子有機(jī)物外滲，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的平衡受到影響，進(jìn)而影響正常的細(xì)胞生理代謝功能[17]。SOD在提高植物抵抗逆境方面有重要的作用。一般情況下，重金屬的毒害導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的O2-，為消除這種影響，植物本身通過(guò)提高SOD酶活性來(lái)催化轉(zhuǎn)化O2-為H2O2，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[18]，因此植物SOD活性隨重金屬的升高而逐漸增大，本研究中，苦草脅迫培養(yǎng)14d中，T1至T4處理階段的SOD活性確實(shí)符合這一特征，而T5處理組中的Cu2+單一脅迫和復(fù)合脅迫卻呈下降趨勢(shì)，這可能是由于重金屬的脅迫已經(jīng)超出了苦草的耐受力，抑制了植物本身的酶活性，所以出現(xiàn)了SOD先升后降的現(xiàn)象。Cu2+、Zn2+都是植物生長(zhǎng)所需的元素，能夠參與其正常的生理活動(dòng)，有利于細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)胞物質(zhì)交換[19]，這也是三種處理的T1處理組SOD值均略低于對(duì)照組的原因。另外，可能是由于Zn2+的存在降低了Cu2+對(duì)苦草的傷害，緩和了部分重金屬的影響，導(dǎo)致三種處理方式對(duì)苦草的抑制性表現(xiàn)為：Cu2+脅迫>復(fù)合脅迫>Zn2+脅迫。

POD催化H2O2分解成H2O和O2[20]，其受重金屬脅迫變化規(guī)律與SOD非常類似，在實(shí)驗(yàn)前期隨重金屬的升高而顯著增大，但在高濃度的影響下卻開(kāi)始降低。本研究中，三種脅迫的T5處理組中均有觀察到POD顯著下降的現(xiàn)象，說(shuō)明高濃度的重金屬脅迫破壞了正常的酶功能，導(dǎo)致酶系統(tǒng)清除活性氧的能力減弱，H2O2和O2-等大量積累，引發(fā)細(xì)胞正常生理功能混亂，與SOD降低的原因相似，這里和計(jì)汪棟[21]等人的研究結(jié)果符合得很好。MDA含量代表細(xì)胞膜被氧化的程度[22]，用來(lái)反映植物逆境或衰老過(guò)程膜脂的破壞程度，含量越高表明植物受抑制的程度越嚴(yán)重[23]。MDA含量過(guò)高或過(guò)低都可能對(duì)植物的光合作用造成影響[24]。本實(shí)驗(yàn)中苦草的MDA含量隨重金屬濃度的升高呈顯著上升趨勢(shì)，說(shuō)明苦草的生命活動(dòng)受重金屬抑制情況明顯加重。徐勤松[25]等人的研究成果也證實(shí)重金屬能導(dǎo)致植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)明顯上升。T5處理組中Cu2+和Zn2+單一脅迫下的MDA值達(dá)到最大，但復(fù)合脅迫卻使得其活性降低，可能是由于此兩種重金屬之間的相互作用導(dǎo)致MDA酶活性受影響程度明顯增加，進(jìn)而導(dǎo)致植物體本身的酶保護(hù)系統(tǒng)遭到破壞，因此T5處理組中的MDA含量明顯降低。三種抗氧化酶活性中，除SOD外，POD和MDA的復(fù)合處理所造成的影響較兩種重金屬單一脅迫更大，其次是Cu2+單一脅迫，Zn2+產(chǎn)生的影響最小，可能由于Cu是非常活躍的氧化還原型過(guò)渡金屬元素，它能吸收或釋放一個(gè)電子(Cu2+/Cu+)，從而產(chǎn)生自由基導(dǎo)致?lián)p傷[26]，而Zn的化學(xué)性質(zhì)比Cu要弱的多。

葉綠素a和葉綠素b對(duì)苦草光合作用的進(jìn)行都具有重大幫助。葉綠素a+b能夠反映植物葉片光合活性的強(qiáng)弱，代表對(duì)光能的利用率[27]。本研究中，葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的T1處理組各葉綠素含量略高于對(duì)照組，其原因可能是少量的Cu2+、Zn2+都能夠有助于合成葉綠素。T1到T5處理組中各葉綠素含量指標(biāo)隨重金屬脅迫濃度的升高而顯著降低，在實(shí)驗(yàn)中也可以看到苦草葉片表面明顯失綠的現(xiàn)象。有學(xué)者認(rèn)為重金屬離子與葉綠體蛋白上的巰基結(jié)合[28]，破壞了葉綠體的基本結(jié)構(gòu)；此外，重金屬還能夠與某些合成葉綠素的酶(原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶)相結(jié)合，使得酶活性大幅下降，阻礙了葉綠素的合成[29]。本研究中，葉綠素a比葉綠素b下降更快，說(shuō)明葉綠素a對(duì)重金屬更敏感。Cu2+、Zn2+對(duì)苦草葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b的抑制性表現(xiàn)為：復(fù)合脅迫>Zn2+脅迫>Cu2+脅迫。Ca/Cb始終呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明兩種重金屬都能加速苦草葉片的衰老，且復(fù)合脅迫的降低幅度最大，Zn2+單一脅迫變化程度最小。就對(duì)苦草抑制性而言，復(fù)合脅迫>Cu2+單一脅迫>Zn2+單一脅迫。

4 結(jié)論

Cu2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對(duì)苦草的抗氧化酶活性和葉綠素含量均能產(chǎn)生抑制作用。

除SOD活性外，三種脅迫對(duì)苦草POD、MDA和各葉綠素含量的抑制效果表現(xiàn)為協(xié)同作用。