腦腸肽在大鼠胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織與血清中的表達(dá)影響*

高娜 彭玉 劉啟艷 龐平

腦腸肽是指在胃腸道和腦中雙重分布的肽類統(tǒng)稱，目前已發(fā)現(xiàn)的50多種胃腸肽中，至少有20多種也分布于腦中[1]。LP、NPY、CCK-8是三種重要的腦腸肽，近年來對三種腦腸肽參與攝食行為調(diào)控報道較多，研究靶點多以血清或血漿為主，而作為腦腸肽分泌的重要器官-胃腸道、下丘腦相關(guān)組織研究報道相對較少[2-3]，對LP、NPY、CCK-8在胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織與血清中的分布規(guī)律與調(diào)控攝食行為作用是否存在關(guān)聯(lián)性不詳。為此，課題組將胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織與血清中LP、NPY、CCK-8蛋白表達(dá)進(jìn)行比較研究，以了解表達(dá)的差異性，以探究胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織與血清中三種腦腸肽表達(dá)是否存在相關(guān)性，為擬開展厭食大鼠胃腸、下丘腦組織腦腸肽相關(guān)實驗研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗動物：本實驗時間為2018年7月，選取SPF級SD大鼠10只，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家實驗動物中心提供[許可證號SYXK（鄂）2015-0084]，體重（150±10）g，雌雄各半，5只/籠，正常飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，濕度為45%～65%。光照12 h明暗交替。每日記錄大鼠精神狀態(tài)、飲食、毛發(fā)等。（2）試劑與儀器：CCK-8ELISA試劑盒（RA20802，Bioswamp），LPELISA試劑盒（RA20489，Bioswamp），NPYELISA試劑盒（RA20022，Bioswamp）等。EL10A自動酶標(biāo)儀（BIOBASE），DEM-3自動洗板機(jī)（北京托普），ST70-2微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐）。

1.2 方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，禁飲禁食12 h后依次采集血清、大鼠下丘腦、胃竇、結(jié)腸組織。3%水合氯醛6 mL/kg麻醉大鼠后股動脈采血并脫頸處死。組織剪從枕骨大孔向矢狀縫剪開至鼻準(zhǔn)部，止血鉗剝離顱骨，暴露完整的全腦組織，取全腦后沖洗表面血液，取腹面正中呈菱形的下丘腦組織；之后暴露腹腔，取全胃，截取沿距幽門0.5 cm前壁大彎側(cè)的胃竇部組織，最后快速自肛門上2 cm取結(jié)腸約5 cm。上述組織均在取材后清洗干凈，并迅速分裝于EP管，-80 ℃保存待備檢。全血分離出血清后-80 ℃保存待備檢。

1.3 觀察指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA法）檢測血清、胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織中LP、NPY、CCK-8蛋白的表達(dá)。具體操作參照LP、NPY、CCK-8ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦腸肽在血清中的表達(dá) LP、NPY、CCK-8蛋白濃度含量在血清中均有表達(dá)，三種腦腸肽在外周血清中含量以LP蛋白濃度含量表達(dá)最高，其次為NPY，最低為CCK-8。

2.2 腦腸肽在各組織中表達(dá)比較 LP蛋白在下丘腦中表達(dá)最高，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），在胃竇表達(dá)分別與結(jié)腸、下丘腦中比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；NPY蛋白在結(jié)腸中表達(dá)最高，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），在胃竇中表達(dá)分別與結(jié)腸、下丘腦中比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；CCK-8蛋白在下丘腦中表達(dá)最高，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），在胃竇中表達(dá)分別與結(jié)腸、下丘腦中比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.3 腦腸肽在組織與血清中表達(dá)比較 LP蛋白在血清表達(dá)中最高，在血清中的表達(dá)均顯著高于在各組織中，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；NPY蛋白表達(dá)在結(jié)腸組織最高，在結(jié)腸組織中的表達(dá)顯著高于血清中，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；CCK-8蛋白表達(dá)在下丘腦組織最高，在下丘腦組織中表達(dá)顯著高于血清中，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表1 腦腸肽在各組織中濃度表達(dá)比較[pg/mL，（）]

表1 腦腸肽在各組織中濃度表達(dá)比較[pg/mL，（）]

*與胃竇組織比較，P<0.01。

表2 腦腸肽在組織與血清中表達(dá)比較[pg/mL，（）]

表2 腦腸肽在組織與血清中表達(dá)比較[pg/mL，（）]

*與胃竇組織比較，P<0.01；＃與結(jié)腸組織比較，P<0.01；△與下丘腦組織比較，P<0.01。

3 討論

近年來許多研究表明，腦-腸之間存在著一個復(fù)雜的神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，這個網(wǎng)絡(luò)將腦與胃腸道聯(lián)系了起來，故被稱為腦腸軸。腦腸軸是胃腸道功能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用的雙向調(diào)節(jié)軸[4]。腦腸肽作為腦腸軸中重要的因子，在腦腸軸各個環(huán)節(jié)中，起著重要的調(diào)控功能作用[5]。這些腦腸肽不僅存在于胃腸道內(nèi)，也存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，它們一方面作為激素調(diào)節(jié)和影響于外周的器官，另一方面作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)作用于胃腸道感覺神經(jīng)末梢或平滑肌細(xì)胞的相應(yīng)受體，從而起到對胃腸功能的調(diào)控作用[6]。胃腸道是腦-腸軸體系中重要的參與者，動物營養(yǎng)物質(zhì)的攝入與食欲息息相關(guān)，食欲調(diào)節(jié)包括長期和短期調(diào)節(jié)。長期食欲調(diào)節(jié)反映了機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)，短期食欲調(diào)節(jié)是由胃腸道分泌的腦腸肽傳遞信號給下丘腦和腦干，通過交互作用來調(diào)節(jié)動物攝食開始或結(jié)束[7]。臨床研究中也發(fā)現(xiàn)治療小兒厭食癥的機(jī)制也可能與其調(diào)節(jié)體內(nèi)的食欲調(diào)節(jié)因子即腦腸肽有關(guān)[8]。越來越多法的研究發(fā)現(xiàn)多種腦腸肽參與攝食行為的調(diào)控，其中LP、NPY、CCK-8的研究報道較多[9-11]。

文獻(xiàn)[12]報道LP是由肥胖基因編碼的一種由167個氨基酸組成的蛋多肽類激素。它主要由白色脂肪組織產(chǎn)生及分泌，進(jìn)入血液循環(huán)后，游離或與瘦素結(jié)合蛋白結(jié)合，最后通過多種組織及多種形式的瘦素受體，作用于中樞和外周的多個位點，調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡[13]。生理狀態(tài)下LP通過與下丘腦相關(guān)的反饋環(huán)實現(xiàn)抑制攝食、增加能量消耗，在脂肪儲存過程中發(fā)揮重要的作用。下丘腦部位存在多種調(diào)節(jié)進(jìn)食的神經(jīng)肽感受器分子，它們共同組成了一個食欲刺激網(wǎng)絡(luò)[14]。本研究結(jié)果顯示，在血清中LP蛋白濃度表達(dá)明顯高于NPY和CCK-8，LP血清蛋白高濃度可能與其由脂肪細(xì)胞分泌后進(jìn)入血液循環(huán)有一定關(guān)聯(lián)性。LP在血清與組織中表達(dá)比較，在血清中的表達(dá)明顯高于組織中（P<0.01），組織中以下丘腦蛋白濃度最高；下丘腦LP蛋白濃度高表達(dá)可能與下丘腦是調(diào)節(jié)進(jìn)食的神經(jīng)肽感受器分子有關(guān)。

NPY是一種含36個氨基酸，分子量為4.2 KD的小肽。迄今為止，已有大量研究表明，NPY廣泛分布于哺乳動物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及組織、器官和腺體中，與許多部位的神經(jīng)元中其他神經(jīng)遞質(zhì)如去甲腎上腺素共存，還可以由非神經(jīng)元細(xì)胞合成及釋放。其中，在神經(jīng)系統(tǒng)中的含量最高。NPY可促進(jìn)動物的攝食行為、調(diào)控機(jī)體能量平衡，作為下丘腦食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的促食欲因子[15]。在胃腸道方面，NPY可促進(jìn)十二指腸、空腸和結(jié)腸的蠕動，促進(jìn)進(jìn)食[16]。本研究結(jié)果顯示NPY蛋白在結(jié)腸組織與下丘腦均較高，提示NPY在腸、中樞對食欲調(diào)節(jié)的功能相當(dāng)，但結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯高于胃竇組織（P<0.01），由此推測結(jié)腸組織對胃腸腦腸肽以及食欲調(diào)節(jié)可能更顯著。

CCK由腸道Ⅰ細(xì)胞分泌的33個氨基酸組成，前體具有115個氨基酸殘基，分子形式包括CCK-5、CCK-7、CCK-8、CCK-18等。CCK主要存在于哺乳動物大腦和胃腸道中，是一種重要的腸道激素和神經(jīng)遞質(zhì)[17]。CCK在腦內(nèi)主要以CCK-8的形式存在，CCK-8具有CCK全部生物活性，可通過中樞、外周神經(jīng)內(nèi)分泌途徑實現(xiàn)其抑制攝食、減緩胃腸運動、對消化功能的調(diào)節(jié)作用[18]。在中樞，CCK是一種致飽激素，其作用于下丘腦的食欲中樞，可產(chǎn)生致飽效應(yīng)[19]。外周CCK既能與胃腸道迷走神經(jīng)上CCK-1受體（CCK1，CCK1R）結(jié)合延遲胃排空，又能激活胃腸道迷走神經(jīng)元上行通道產(chǎn)生信號沖動，傳入下丘腦孤束核（NTS）神經(jīng)元，減少攝食[20]。本研究結(jié)果顯示，CCK-8蛋白濃度在下丘腦與結(jié)腸組織濃度均較高，提示CCK-8在中樞、腸對食欲調(diào)節(jié)的功能相當(dāng)，但下丘腦組織表達(dá)明顯高于血清（P<0.01），由此推測中樞、腸對食欲調(diào)節(jié)可能比外周血清更顯著。

本研究結(jié)果顯示，腦腸肽在下丘腦組織中含量偏高，推測下丘腦組織是中樞腦腸肽主要分泌部位，在食欲中樞調(diào)控中起著重要的主導(dǎo)作用。在胃腸道方面，研究結(jié)果顯示胃竇、結(jié)腸組織均有LP、NPY、CCK-8三種腦腸肽表達(dá)，但結(jié)腸組織的蛋白濃度整體表達(dá)高于在胃竇組織中（P<0.01），由此推測結(jié)腸組織對胃腸腦腸肽以及食欲調(diào)節(jié)可能強于胃竇，占主要地位。

綜上所述，胃竇、結(jié)腸、下丘腦組織和血清中LP、NPY、CCK-8蛋白均是參與攝食行為調(diào)控的重要肽類，腦腸肽在組織與血清表達(dá)存在的差異性，可能與肽類分泌部位、來源途徑不同有關(guān)，與其發(fā)揮作用機(jī)理、靶點不同有關(guān)，本研究結(jié)果為今后探索“腦腸肽-食欲中樞”紊亂發(fā)生厭食的機(jī)理研究奠定了理論基礎(chǔ)。