產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率、基因型分布及其耐藥性分析*

周鷹豪 蔡志軍 劉軍

β-內(nèi)酰胺酶環(huán)對(duì)單環(huán)內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、青霉素類等多種抗菌藥物具有抗菌活性結(jié)構(gòu)，可損傷細(xì)菌胞壁，使其裂解，應(yīng)用廣泛[1-2]。但β 內(nèi)酰胺酶可對(duì)β 內(nèi)酰胺類抗生素的β 內(nèi)酰胺環(huán)水解，使抗生素結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的靶位點(diǎn)改變，或難以與細(xì)菌靶位結(jié)合，使抗菌活性消失或降低，而細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）[3-4]。目前臨床使用抗生素多為經(jīng)驗(yàn)性用藥，但因不同基因型ESBLs對(duì)抗菌藥物水解特性不同，增加治療難度，影響抗菌治療效果。大腸埃希菌是產(chǎn)ESBLs的主要菌種，隨著抗菌藥物廣泛、大量使用，其耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。為此，本研究旨在分析產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率、基因型分布及其耐藥性，為指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2018年1月-2020年1月醫(yī)院細(xì)菌室經(jīng)患者血液、傷口分泌物、痰液中分離出的大腸埃希菌82株。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 美國(guó)BD公司的phoenix-100的確證藥敏紙片和MH培養(yǎng)基，美國(guó)BD公司的phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀；分別購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司、上海博尚生物技術(shù)有限公司、美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)體系、反應(yīng)引物、擴(kuò)增儀。

1.2.2 產(chǎn)ESBLs表型確證實(shí)驗(yàn) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）推薦的雙紙片協(xié)同試驗(yàn)法檢測(cè)產(chǎn)ESBLs表型，將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙壕鶆蛲磕ㄓ贛H瓊脂平板，并分別貼上頭孢噻肟/克拉維酸藥敏紙片（30/10 μg）、頭孢噻肟藥敏紙片（30 μg）、頭孢他啶藥敏紙片（30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸藥敏紙片（30/10 μg），35 ℃下孵育17 h，測(cè)量抑菌圈，抑菌圈直徑減去不含克拉維酸藥敏紙片所產(chǎn)生的抑菌圈直徑≥5 mm，則結(jié)果評(píng)定為產(chǎn)ESBLs陽(yáng)性菌株。

1.2.3 PCR反應(yīng) 將純培養(yǎng)大腸埃希菌置入0.5 mL的離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200 ng/mL蛋白K溶液200 μL），95 ℃水浴10 min，15 000 r/min離心操作30 s，離心半徑為6 cm，取上清液作為基因檢測(cè)的模板液。PCR反應(yīng)體系組成：10倍PCR擴(kuò)增緩沖液5 μL、上游引物1 μL、dNTP混合物4 μL、模板液2 μL、無(wú)菌去離子水36.75 μL、下游引物1 μL、premix Taq DNA聚合酶0.25 μL。反映程序：分別行94 ℃預(yù)變性2 min與變性30 s，30 s的49～53 ℃退火，72 ℃退火1 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min 。PCR序列、反應(yīng)引物見(jiàn)表1。

表1 PCR序列、反應(yīng)引物

1.2.4 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行細(xì)菌鑒定操作[5]，將標(biāo)本接種麥康凱平板和哥倫比亞血瓊脂平板，四區(qū)劃線，置入CO2培養(yǎng)箱中孵育16～18 h，溫度為37 ℃，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落特征進(jìn)行觀察，挑選單個(gè)菌落實(shí)施革蘭染色，選取革蘭陰性桿菌用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀及其配套試劑進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。將生理鹽水3 mL加入比濁管中，在比濁儀上實(shí)施空白對(duì)照，濁度歸零。從培養(yǎng)皿上用無(wú)菌一次性拭子挑取菌落，置入比濁管中不斷研磨混勻，將菌懸液濃度調(diào)節(jié)至濁度0.50～0.63麥?zhǔn)蠁挝?。在樣品架上間隔放置僅裝有3 mL生理鹽水的比濁管和含菌懸液比濁管，用移液器從含菌懸液比濁管中吸取菌懸液145 μL，加入相鄰的生理鹽水比濁管中，反復(fù)吹打均勻。從冰箱中取出革蘭陽(yáng)性桿菌鑒定卡和藥敏卡，放置于室溫下約2 min，分別置入對(duì)應(yīng)比濁管，確?？ㄆ陷敇庸艹浞窒萑胫辆鷳乙褐?。置入全自動(dòng)微生物分析儀的加樣艙，艙門關(guān)上，點(diǎn)擊START FILL充分吸樣約70 s。將標(biāo)本取出，放入孵育艙孵育18～24 h。將電腦軟件主頁(yè)面打開，對(duì)卡面信息核對(duì)，依次輸入菌株樣本號(hào)子相應(yīng)表格、保存。在電腦Lis系統(tǒng)中輸入分泌儀鑒定分析的生化藥敏結(jié)果，根據(jù)細(xì)菌在不同濃液藥物中生長(zhǎng)情況判讀耐藥和敏感情況。

1.3 觀察指標(biāo) 分析產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率、耐藥性、基因型分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率與基因型分布情況 82株大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率為53.66%（44/82），其中43株（97.73%）為BlaCTX-M基因型，其中以BlaCTX-M-9為主，其余1株攜帶BlaTEM基因型，經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ?，菌株為BlaTEM-1型。見(jiàn)表2。

表2 BlaCTX-M基因型分布情況

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要基因分型耐藥性分析 BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑林耐藥率為100%，對(duì)亞胺培南的耐藥率為0，對(duì)左氧氟沙星耐藥率90%以上。BlaCTX-M-1對(duì)頭孢吡肟、氨曲南、頭孢他啶耐藥率高于BlaCTX-M-9，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要基因分型耐藥性分析 株（%）

3 討論

大腸埃希菌是廣泛存在于自然界中的重要條件致病菌，當(dāng)機(jī)體菌群失調(diào)、免疫抑制變?nèi)趸蚣木硬课桓淖儠r(shí)，其能導(dǎo)致腸道外感染，導(dǎo)致患者出現(xiàn)多個(gè)器官、部位的感染[6-8]。大腸埃希菌感染可從血液、尿液、分泌物、痰液、腹水等多種臨床標(biāo)本中分離到，可見(jiàn)于臨床各個(gè)科室，其主要致病物質(zhì)為黏附素、定居因子、內(nèi)毒素、外毒素等。大腸埃希菌具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，其主要耐藥機(jī)制為ESBLs[9-10]。ESBLs是主要產(chǎn)生于革蘭陰性桿菌的水解酶類，可對(duì)絕大部分氧亞氨基頭孢菌素類和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物水解，進(jìn)而對(duì)該類藥物產(chǎn)生耐藥。ESBLs基因種類多樣，不同基因型酶耐藥譜和不同地區(qū)、不同醫(yī)院流行的ESBLs基因型均存在一定差異。本研究結(jié)果顯示，82株大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率為53.66%（44/82）。BlaCTX-M基因型分布最高，BlaCTX-M-9為主，其次為BlaCTX-M-1，提示大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs攜帶率較高，BlaCTX-M為最常見(jiàn)分型，并以BlaCTX-M-9型為主，與楊宏斌等[11]研究存在一定差異。不同地區(qū)、醫(yī)院大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs攜帶率存在一定差異，這與不同醫(yī)院對(duì)感染控制力度差異和使用抗生素情況不同以及各地衛(wèi)生條件不同等因素有關(guān)[12-14]。

ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)，可經(jīng)整合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式在異種或同種細(xì)菌間傳播，并融合其他耐藥基因，造成ESBLs菌株多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和廣泛傳播。產(chǎn)ESBLs菌株與非產(chǎn)ESBLs菌株相比，耐藥現(xiàn)象更嚴(yán)重，其對(duì)臨床常用的頭孢菌素類、喹諾酮類、青霉素類、單環(huán)類抗菌藥物的耐藥性較高，還會(huì)對(duì)磺胺類、氨基糖昔類、氟喳諾酮等抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象，易誘發(fā)醫(yī)院內(nèi)交叉感染[15-17]。本研究中，BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1對(duì)頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢噻肟的耐藥率為100%。ESBLs屬于絲氨酸蛋白酶的衍生物，能水解所有頭孢菌素類、青霉素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類氨曲南等，故產(chǎn)生耐藥。BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1對(duì)左氧氟沙星耐藥率>90%。研究顯示，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹喏酮類的耐藥基因qnr和aac（6'）-Ib-cr，耐藥機(jī)制與BlaCTX-M相同[18-20]。故BlaCTX-M通過(guò)整合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式對(duì)喹諾酮類藥產(chǎn)生耐藥。與BlaCTX-M-9相比，BlaCTX-M-1對(duì)頭孢他啶、氨曲南、頭孢吡肟耐藥率較高，這可能與BlaCTX-M-15亞型有關(guān)。因240（D240G）和Ambler（P167 S/T/Q）位點(diǎn)出現(xiàn)替代，造成BlaCTX-M-15的β 側(cè)鏈與Ω 環(huán)的活性位點(diǎn)易與頭孢吡肟、氨曲南、頭孢他啶結(jié)合，使BlaCTX-M-1對(duì)上述抗菌藥物的水解活性進(jìn)一步提高。

綜上所述，大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs攜帶率較高，BlaCTX-M為最常見(jiàn)分型，并以BlaCTX-M-9型為主，不同基因型ESBLs耐藥機(jī)制存在一定差異，臨床需根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的抗菌藥物。