Myriocin 抑制脂質(zhì)誘導(dǎo)的整合應(yīng)激反應(yīng)延緩ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展研究

于澤謀 李永超 郝洪軍 黃一寧 彭清

有研究顯示，整合應(yīng)激反應(yīng)與代謝性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)［1］。整合應(yīng)激反應(yīng)系指真核生物受到不同刺激后，觸發(fā)真核翻譯起始因子2 α（eIF2α）在絲氨酸第51 位點(diǎn)磷酸化而介導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)［2］，但持續(xù)性整合應(yīng)激反應(yīng)或嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)則可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究顯示，高脂飲食可使細(xì)胞攝取過(guò)多脂質(zhì)而致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)［3］，而蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通過(guò)與未折疊蛋白相結(jié)合激活eIF2α，進(jìn)而誘發(fā)整合應(yīng)激反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過(guò)程中，整合應(yīng)激反應(yīng)具有促進(jìn)炎癥小體形成和炎性因子釋放的作用［1］，且持續(xù)存在并貫穿于粥樣硬化斑塊（以下簡(jiǎn)稱斑塊）發(fā)生發(fā)展之全過(guò)程［4］，抑制該反應(yīng)可減少泡沫細(xì)胞形成、抑制炎癥反應(yīng)，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［5］。本課題組前期研究顯示，絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（SPT）抑制劑Myriocin 可以延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，但其潛在作用機(jī)制尚未闡明［6］。本研究旨在探索Myriocin對(duì)血管整合應(yīng)激反應(yīng)的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 基因背景為C57BL/6J 雄性無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠共18 只，11 周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18 ～22 ℃、濕度50%～60%，12 h 晝-12 h 夜循環(huán)照明，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后予高脂飼料（21%豬油+0.15%膽固醇，4.554 kCal/g，購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程嚴(yán)格遵循北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度（決議號(hào)：J201818）。

2.試劑與儀器 （1）藥品與試劑：Myriocin 和紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司和Beckman Coulter公司。別藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的CD115 抗體和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的淋巴細(xì)胞抗原6 復(fù)合體（Ly?6c）抗體（均1 ∶100）由美國(guó)Ebioscience 公司提供；TRIzol試劑為美國(guó)Life Technologies 公司產(chǎn)品，引物序列由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，TransScript First?Strand cDNA Synthesis SuperMix 和TransStart Top Green qPCR SuperMix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液由北京普利萊基因技術(shù)公司提供，二辛可寧酸（BCA）檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Thermo Pierce 公司產(chǎn)品，ECL 發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，Ⅰ抗工作液主要包括eIF2α、肌醇依賴酶1α（IRE1α）、活化轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）、p65核因子?κB（p65 NF?κB）和磷酸化p65 NF?κB 抗體（均1 ∶1000）購(gòu)自美國(guó)CST 公司，磷酸化IRE1α抗體（1 ∶1000）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，Caspase12 抗體（1 ∶1000）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，單核細(xì)胞趨化蛋白?1（MCP?1）抗體（1 ∶100）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶5000）由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶1000）為美國(guó)Jackson Immuno Research 公司產(chǎn)品。（2）設(shè)備與儀器：FACSCaliburTM 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，全自動(dòng)生化分析儀由美國(guó)Beckman 公司提供，石蠟切片機(jī)為德國(guó)Leica 公司產(chǎn)品，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（CEX Connect Real?Time System）由美國(guó)Bio?Rad 公司提供，GBOX?CHEMI?XT4 型曝光儀為美國(guó)Syngen 公司產(chǎn)品，Eclipse Ti2 型光學(xué)顯微鏡和A1MP 型熒光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 18 只ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，于12 周齡時(shí)予高脂飼料和灌胃處理，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組予以磷酸鹽緩沖液+ 5% Tween 80 灌 胃，Myriocin 組 予 以Myriocin 0.30 mg/（kg·d）［7］溶于磷酸鹽緩沖液+5% Tween 80灌胃，灌胃容積均為100 μl/d，以免引起小鼠胃部不適或影響進(jìn)食，持續(xù)喂養(yǎng)12 周。

2. 血清脂質(zhì)測(cè)定 高脂飲食和灌胃處理12 周后，摘眼球采血約800 μl，4 ℃靜置2 ～3 h，2737×g離心15 min。取上清液約200 μl，由北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科完成血清脂質(zhì)［包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL?C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）］測(cè)定。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞亞群比例 乙二胺四乙酸（EDTA）包被的EP 管中加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液400 μl；高脂飲食和灌胃處理8 周后即小鼠20 周齡 時(shí)，于 尾 靜 脈 采 血 約100 μ l；滴 加APC 標(biāo) 記 的CD115 抗 體（1 ∶100）和PE 標(biāo) 記 的Ly?6c 抗 體（1 ∶100）各5 μl，設(shè)立同型對(duì)照管，室溫孵育約30 min；1173×g 離心5 min，棄上清液；滴加紅細(xì)胞裂解液600 μl，振蕩混勻，相同條件離心5 min，棄上清液；滴加磷酸鹽緩沖液1 ml、振蕩重懸，相同條件下離心5 min，棄上清液，重復(fù)操作一遍；最后滴加磷酸鹽緩沖液200 μl、重懸，1 h 內(nèi)上機(jī)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，采用FlowJo 流式細(xì)胞分析軟件計(jì)算Ly?6chigh亞型單核細(xì)胞比例。

4.HE 染色和免疫熒光染色 以冷生理鹽水灌注小鼠心臟，平行左右心耳連線下方約0.50 cm 處切開(kāi)心臟，將心臟基底部連同升主動(dòng)脈置于4%多聚甲醛溶液固定24 h；石蠟包埋，對(duì)主動(dòng)脈竇部連續(xù)切片，層厚為4 μm，脫蠟、水化。（1）HE 染色：蘇木素染細(xì)胞核4 min、伊紅染色2 min，脫水、透明、封片；采用Image?Pro Plus 圖像分析軟件定量測(cè)定主動(dòng)脈斑塊面積，為避免切片角度帶來(lái)的誤差，計(jì)算斑塊相對(duì)面積［斑塊相對(duì)面積（%）=主動(dòng)脈斑塊面積/主動(dòng)脈竇管腔面積×100%］。（2）免疫熒光染色：切片置于pH 值為9 的抗原修復(fù)液中，94 ℃水浴15 min，10%山羊血清封閉，室溫孵育1 h，滴加MCP?1 抗體（1 ∶100）200 μl，4 ℃濕盒內(nèi)過(guò)夜孵育，磷酸鹽緩 沖 液 沖 洗5 min（×5 次），滴 加Alexa Fluor 488 標(biāo) 記 的 山 羊 抗 兔IgG Ⅱ抗（1 ∶1000）200 μ l，37 ℃濕 盒 內(nèi) 孵 育30 min，DEPI 封片液封片，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察MCP?1 陽(yáng)性率，呈綠色熒光為MCP?1表達(dá)陽(yáng)性。

5.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)炎癥反應(yīng)和整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子mRNA的表達(dá) 冷生理鹽水灌注小鼠心臟，剝離主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈，分為兩段，將下段血管組織置于不含RNA 酶EP 管中，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中，再至?80 ℃冰箱保存；冰上勻漿組織，提取總RNA 10 μg，建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，獲得cDNA；建立熒光定量PCR 反應(yīng)體系，引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)總體積20 μl，包括Template 1 μl，10 μ mol/L 正 向 引 物 和 逆 向 引 物 各0.50 μ l，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μl，RNase?free Water 8 μl；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)熱10 min、94 ℃變 性5 s、60 ℃退 火40 s、65 ℃延 伸5 s，共40 個(gè) 循環(huán)。以β?肌動(dòng)蛋白（β?actin）為內(nèi)參照物，采用2-△△CT法計(jì)算炎癥反應(yīng)和整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量。炎癥反應(yīng)相關(guān)分子包括炎性因子白細(xì)胞介素?1β和6（IL?1β和IL?6）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、細(xì)胞間黏附分子?1（ICAM?1）、血管細(xì)胞黏附分子?1（VCAM?1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），以及抗炎性因子IL?10；整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子包括葡萄 糖 調(diào) 節(jié) 蛋 白78（GRP78）、PERK、eIF2 α、ATF4、ATF6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)促凋亡蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）和Caspase12。

6.Western blotting 法檢測(cè)整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)變化 提取血管組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白總量；行十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），電壓150 V、持續(xù)時(shí)間40 min；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，恒流200 mA、持續(xù)120 min；5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h；滴加eIF2α、ATF4、IRE1α和磷酸化IRE1α、p65 NF?κB 和磷酸化p65 NF?κB、Caspase12（均1 ∶1000）5 ml，4 ℃搖床過(guò)夜孵育，TBST 緩沖液洗滌5 min（×5 次），滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶5000）；滴加ECL 發(fā)光液，自動(dòng)曝光成像。以β?肌動(dòng)蛋白或者α?微管蛋白（α?tubulin）為內(nèi)參照物，采用Image J 軟件計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 1. Gene?specific primers

三、統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。采用Levene 方差齊性檢驗(yàn)檢測(cè)方差齊性，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)；呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann?Whitney U 檢驗(yàn)。以P ≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)Myriocin 灌胃12 周后，小鼠血清LDL?C 水平低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.012），而TC、TG、VLDL?C 和HDL?C 水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05，表2）。

流式細(xì)胞術(shù)分析，經(jīng)Myriocin 灌胃8 周后小鼠Ly?6chigh亞群?jiǎn)魏思?xì)胞比例低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011，表3）。

HE 染色顯示，所有小鼠主動(dòng)脈竇均發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，但Myriocin 組斑塊面積小于對(duì)照組（圖1）。進(jìn)一步定量分析，距主動(dòng)脈瓣200 和300 μm處，Myriocin 組小鼠斑塊面積小于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045，0.003；表4）。脂質(zhì)壞死核是易損斑塊的特征，Myriocin 組小鼠主動(dòng)脈竇脂質(zhì)壞死核相對(duì)面積小于對(duì)照組（P=0.004），表明Myriocin可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展（表5）。

表2 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠血清脂質(zhì)水平的比較（±s，mmol/L）Table 2. Comparison of serum lipids between Myriocin group and control group (±s, mmol/L)

表2 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠血清脂質(zhì)水平的比較（±s，mmol/L）Table 2. Comparison of serum lipids between Myriocin group and control group (±s, mmol/L)

TC，total cholesterol，總膽固醇；TG，triglyceride，甘油三酯；LDL?C，low density lipoprotein?cholesterol，低密度脂蛋白膽固醇；VLDL?C，very low density lipoprotein?cholesterol，極低密 度 脂 蛋 白膽固醇；HDL?C，high density lipoprotein?cholesterol，高密度脂蛋白膽固醇

組別對(duì)照組Myriocin 組t 值P 值例數(shù)9 9 TC 43.48± 2.87 37.87±10.26 1.581 0.147 TG 1.01±0.20 1.22±0.34?1.572 0.135 LDL?C 9.96±1.03 8.52±1.12 2.830 0.012 VLDL?C 32.09±2.05 28.18±9.64 1.190 0.265 HDL?C 1.44±0.36 1.16±0.36 1.579 0.134

表3 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠灌胃8 周后Ly?6chigh亞型單核細(xì)胞比例的比較（±s，%）Table 3. Comparison of the percentage of Ly?6chigh monocytes among total monocytes between Myriocin group and control group(±s, %)

表3 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠灌胃8 周后Ly?6chigh亞型單核細(xì)胞比例的比較（±s，%）Table 3. Comparison of the percentage of Ly?6chigh monocytes among total monocytes between Myriocin group and control group(±s, %)

組別對(duì)照組Myriocin 組例數(shù)9 9灌胃8 周后61.49±10.69 49.57± 6.44 t 值2.866 P 值0.011

免疫熒光染色顯示，小鼠主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光標(biāo)記的MCP?1，但Myriocin 組MCP?1 表達(dá)水平低于對(duì)照組（圖2）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 顯示，與 對(duì) 照 組 相 比，Myriocin 組 小 鼠IL?1 β mRNA（P = 0.005）、TNF?α mRNA（P = 0.000）、ICAM?1 mRNA（P = 0.013）、VCAM?1 mRNA（P = 0.001）和VEGF mRNA（P = 0.037）表達(dá)水平均降低，IL?10 mRNA 表達(dá)水平升高（P=0.017），而IL?6 mRNA 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），表明Myriocin 可下調(diào)炎性因子mRNA 的表達(dá)，上調(diào)抗炎性因子mRNA的表達(dá)（表6）。提示Myriocin 可有效抑制血管組織炎癥反應(yīng)。

Myriocin 組小鼠整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子PERK mRNA（P = 0.004）、eIF2α mRNA（P = 0.007）、ATF4 mRNA（P = 0.012）、ATF6 mRNA（P = 0.001）和Caspase12 mRNA（P = 0.000）表 達(dá) 水 平 降 低，而GRP78 mRNA 和CHOP mRNA 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05，表7）。Western blotting 法顯示，與對(duì)照組相比，Myriocin 組小鼠eIF2α（P=0.047）、ATF4（P=0.011）和磷酸化p65 NF?κB/總p65 NF?κB比 值（P = 0.011）下 降，而 磷 酸 化IRE1 α/總IRE1α 比值和活化型Caspase12/總Caspase12比值組間差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05；表8，圖3 ～7）。表 明Myriocin 可 以 抑 制 由PERK/eIF2α/ATF4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的整合應(yīng)激反應(yīng)。

討 論

Myriocin 源自一種傳統(tǒng)真菌類中藥——冬蟲(chóng)夏草，其作為絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可抑制鞘脂合成，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［6?8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是整合應(yīng)激反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。本課題組的前期研究證實(shí)Myriocin 可延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［6］，本研究進(jìn)一步探討Myriocin 作用機(jī)制是否與抑制整合應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。關(guān)于Myriocin 的劑量，文獻(xiàn)報(bào)道其常用劑量為0.30 mg/（kg·d）［7?14］。Park 等［10］探討不同劑量Myriocin［0.10、0.30 和1 mg/（kg·d）］對(duì)ApoE-/-小鼠血清脂質(zhì)水平和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的影響，其結(jié)果顯示，Myriocin 治療12 周后0.30 mg/（kg·d）組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化面積減少93%。本研究以Park 等［10］的方案為依據(jù)，同樣采取Myriocin 0.30 mg/（kg·d）對(duì)ApoE-/-小鼠灌胃治療。

本研究經(jīng)Myriocin 灌胃治療12 周后，小鼠血清LDL?C 水平較對(duì)照組降低。已知Myriocin 藥理作用為抑制鞘脂合成，后者是脂蛋白顆粒的組成成分，因此可部分解釋Myriocin 組小鼠血清LDL?C 水平降低的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈竇部進(jìn)行連續(xù)切片，定量分析斑塊面積和脂質(zhì)壞死核面積，結(jié)果顯示，兩組小鼠主動(dòng)脈竇均發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，但Myriocin 組斑塊面積和脂質(zhì)壞死核面積小于對(duì)照組，表明Myriocin 可有效減小斑塊和脂質(zhì)壞死核面積，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。

外周血單核細(xì)胞在趨化因子的作用下，被募集進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜。Raghavan 等［15］研究顯示，與Ly?6clow表型相比，Ly?6chigh表型單核細(xì)胞更易形成泡沫細(xì)胞。Ly?6chigh表型單核細(xì)胞亞群為經(jīng)典炎性細(xì)胞，可釋放炎性因子，如IL?1、IL?6、TNF?α和MCP?1，導(dǎo)致血管功能障礙和泡沫細(xì)胞聚集［16］。本研究流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，經(jīng)Myriocin 灌胃8 周后，與對(duì)照組相比，Myriocin 組小鼠Ly?6chigh亞群?jiǎn)魏思?xì)胞比例下降約19.39%，表明Myriocin 可有效抑制外周血Ly?6chigh表型單核細(xì)胞，進(jìn)而減少泡沫細(xì)胞的形成。

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察所見(jiàn) HE 染色 ×100 1a 對(duì)照組小鼠存在主動(dòng)脈竇斑塊 1b Myriocin 組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊面積小于對(duì)照組Figure 1 Optical microscopy findings HE staining × 100 Control group mice had atherosclerotic lesions in their arotic sinus(Panel 1a). The lesions were smaller in Myriocin group (Panel 1b).

表4 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊相對(duì)面積的比較（±s，%）Table 4. Comparison of the percentage of plaque area between Myriocin group and control group (±s, %)

表4 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊相對(duì)面積的比較（±s，%）Table 4. Comparison of the percentage of plaque area between Myriocin group and control group (±s, %)

組別對(duì)照組Myriocin 組t 值P 值例數(shù)9 9主動(dòng)脈瓣33.87± 6.38 33.88±10.66?0.002 0.998距主動(dòng)脈瓣100 μm 37.30±6.57 33.34±8.08 1.141 0.271距主動(dòng)脈瓣200 μm 38.02± 5.06 27.60±12.74 2.281 0.045距主動(dòng)脈瓣300 μm 35.38±7.00 23.79±7.03 3.506 0.003

表5 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈竇脂質(zhì)壞死核相對(duì)面積的比較［M（P25，P75），%］Table 5. Comparison of the percentage of necrotic core area between Myriocin group and control group[M (P25, P75), %]

已知炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的泡沫細(xì)胞形成和斑塊不穩(wěn)定密切相關(guān)。本研究免疫熒光染色觀察兩組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光標(biāo)記的MCP?1，但Myriocin 組MCP?1 水平低于對(duì)照組；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 顯示，Myriocin 組小鼠炎性因子IL?1 β mRNA、TNF?α mRNA、ICAM?1 mRNA、VCAM?1 和VEGF mRNA 低于對(duì)照組，抗炎性因子IL?10 mRNA 水平高于對(duì)照組，表明Myriocin 具有抑制血管組織炎癥反應(yīng)的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可上調(diào)分子伴侶GRP78 的表達(dá)，促使GRP78 與PERK、IRE1α和ATF6 解離，啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)［17］；活化的PERK 可使下游底物eIF2α磷酸化，抑制蛋白質(zhì)合成，同時(shí)上調(diào)ATF4 的表達(dá)［18］；長(zhǎng)期過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)可上調(diào)CHOP 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［19］。既往研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展至晚期，凋亡的巨噬細(xì)胞不能及時(shí)有效清除，繼發(fā)壞死，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和斑塊進(jìn)展［20］。細(xì)胞器應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在交叉作用［21?22］。一方面，氧化修飾低密度脂蛋白（ox?LDL）可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)流出，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷［23］；另一方面，巨噬細(xì)胞線粒體應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［24］。研究顯示，PERK 激活eIF2α，既可以全面下調(diào)蛋白質(zhì)合成、上調(diào)ATF4 表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還具有促進(jìn)NF?κB 活化的作用［4，21］。NF?κB 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究檢測(cè)整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示，Myriocin 組小鼠PERK mRNA、eIF2α mRNA、ATF4 mRNA、ATF6 mRNA 和Caspase12 mRNA，以及eIF2α、ATF4 和磷酸化p65 NF?κ B/總p65 NF?κ B 比 值 均 低 于 對(duì) 照 組，表 明Myriocin 可以抑制PERK/eIF2α/ATF4 通路介導(dǎo)的整合應(yīng)激反應(yīng)，以及NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖2 熒光共聚焦顯微鏡觀察所見(jiàn) 免疫熒光染色 ×100 2a 對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)可見(jiàn)MCP?1 蛋白表達(dá)（綠色熒光所示） 2b Myriocin 組小鼠主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)MCP?1 蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組（綠色熒光所示）Figure 2 Fluorescence confocal microscopy findings Immunofluorescence staining × 100 MCP ? 1 was observed in the atherosclerotic lesions of control group (green color indicates, Panel 2a). The expression of MCP?1 was decreased in the atherosclerotic lesions of Myriocin group (green color indicates, Panel 2b).

表6 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠炎癥反應(yīng)相關(guān)分子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較Table 6. Comparison of the mRNA expression levels of inflammation related molecules between Myriocin group and control group

表7 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較Table 7. Comparison of the mRNA expression levels of integrated stress response related molecules between Myriocin group and control group

綜上所述，我們認(rèn)為Myriocin 延緩ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展涉及以下機(jī)制：（1）調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。（2）抑制血管組織脂質(zhì)攝取分子的表達(dá)，如CD36、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體?1（LOX?1）和清道夫受體A 型（SR?A）［6］。（3）抑制炎癥反應(yīng)。（4）抑制整合應(yīng)激反應(yīng)。Myriocin 除了抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展外，還可改善胰島素抵抗、穩(wěn)定糖代謝、緩解肝脂肪變性［25?26］。因此我們認(rèn)為，經(jīng)對(duì)Myriocin 全面系統(tǒng)的藥物安全性評(píng)價(jià)，該藥物在預(yù)防與治療動(dòng)脈粥樣硬化性血管病方面將有一定的臨床應(yīng)用前景，可與調(diào)脂藥聯(lián)合應(yīng)用，尤其適用于對(duì)調(diào)脂藥不敏感或無(wú)法耐受的患者。本研究?jī)H為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的支持；而且未設(shè)置藥物濃度梯度、未監(jiān)測(cè)血藥濃度，所檢測(cè)的指標(biāo)亦不夠全面。進(jìn)一步研究將在設(shè)立藥物濃度梯度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行細(xì)胞水平驗(yàn)證。

表8 Myriocin 組與對(duì)照組小鼠整合應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Table 8. Comparison of the protein expression levels of markers for integrated stress response between Myriocin group and control group

圖3 Western blotting 檢 測(cè) 顯 示，Myriocin 組 小鼠eIF2α表達(dá)水平低于對(duì)照組Figure 3 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of eIF2α.

圖4 Western blotting 檢 測(cè) 顯 示，Myriocin 組 小鼠ATF4 表達(dá)水平低于對(duì)照組Figure 4 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of ATF4.

圖5 Western blotting 檢 測(cè) 顯 示，Myriocin 組 小 鼠IRE1α磷酸化水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著降低Figure 5 Western blotting showed the expression of phosphorylation of IRE1 α was not significantly changed.

圖6 Western blotting 檢測(cè)顯示，Myriocin 組小鼠磷酸化p65 NF?κB 表達(dá)水平低于對(duì)照組Figure 6 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of p65 NF?κB.

圖7 Western blotting 檢測(cè)顯示，Myriocin 組小鼠活化Caspase12 表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著降低Figure 7 Western blotting showed the expression of phosphorylation of cleaved Caspase12 was not significantly changed.

利益沖突無(wú)