JAK2/STAT3信號(hào)通路在右美托咪定抗小鼠腦缺血/再灌注損傷中的作用*

門運(yùn)政， 童旭輝， 胡 淼， 王雪如， 劉 剛， 董淑英△

1蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，蚌埠 2330302蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，蚌埠 233004

隨著世界人口老齡化的加速，腦卒中成為危害中老年人生命健康的主要疾病，且該病具有發(fā)病率高、致殘率高以及死亡率高的特點(diǎn)[1]。腦卒中以缺血性腦卒中居多，其占比可達(dá)80%以上。目前臨床上治療缺血性腦卒中以溶栓為主，但溶栓治療會(huì)帶來腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的不利影響。腦I/R損傷是缺血區(qū)腦組織恢復(fù)血液再灌注所造成的二次損傷，同時(shí)腦I/R損傷也是臨床圍術(shù)期常見的并發(fā)癥。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)作為臨床常用麻醉輔助用藥已被證實(shí)可減輕心臟、腎臟等器官I/R損傷[2-3]。近年來研究表明，DEX可通過抗炎和抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，減輕腦I/R損傷，但其具體的作用機(jī)制尚不明確[4-5]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞中不可缺少的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等生理過程具有重要的調(diào)控作用。有研究表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活可以減輕腦I/R損傷[6-7]。但DEX抗腦I/R損傷的作用是否與JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過建立小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察DEX給藥對(duì)腦I/R損傷JAK2/STAT3信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的影響，探討JAK2/STAT3信號(hào)通路在DEX抗腦I/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所有實(shí)驗(yàn)采用雄性ICR小鼠，鼠齡9～12周，體重25～35 g，共60只，購自山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。小鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在動(dòng)物房中，保持室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度55%～65%，明暗循環(huán)12 h，食物和飲水可自由獲取。

1.2 藥物與試劑

鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恩華)，水合氯醛、多聚甲醛(上海Macklin公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(美國Sigma公司)，JAK2/STAT3抑制劑AG490(Selleck公司)，p-STAT3、STAT3單克隆抗體(美國CST公司)，Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體(Proteintech公司)。

1.3 分組及給藥處理

將60只ICR小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(sham)組、I/R組、I/R+DEX組、I/R+DEX+AG490組。DEX(50 μg/kg)在MCAO前30 min經(jīng)腹腔注射給藥，AG490(5 mg/kg)經(jīng)腹腔注射給藥。

1.4 小鼠MCAO模型的制備

采用改良線栓法制備小鼠MCAO模型。小鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 μL/g)進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于操作臺(tái)。剃去頸部毛發(fā)，用碘伏和乙醇消毒后，沿頸部正中切開，暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈后，繼續(xù)分離出頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用手術(shù)縫合線結(jié)扎，并用小動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉，然后在頸外動(dòng)脈上剪一小口，將線栓從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，略感阻力后停止進(jìn)線，線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈。sham組除線栓只插入頸內(nèi)動(dòng)脈外，其他操作與模型組一致。缺血1 h后拔出線栓，縫合皮膚，恢復(fù)血液再灌注，正常飼養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 神經(jīng)功能障礙評(píng)分

參照Longa五分法對(duì)腦缺血1 h，再灌注24 h的小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分?；顒?dòng)正常無神經(jīng)功能障礙小鼠評(píng)為0分；不能充分伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪者評(píng)為1分；行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈者評(píng)為2分；行走不便，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒者評(píng)為3分；行走嚴(yán)重障礙或無自發(fā)運(yùn)動(dòng)，意識(shí)水平下降者評(píng)為4分。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為1～4分者視為造模成功。

1.6 小鼠腦梗死體積測(cè)定

對(duì)腦缺血1 h，再灌注24 h的小鼠進(jìn)行評(píng)分后，立即取出腦組織，在-20℃冰箱冷凍10～12 min取出，隨后將腦組織做成等距的4片冠狀切片(厚度約2 mm)。將腦片置于1%的TTC染色液中，在37℃恒溫水浴鍋中避光孵育20 min，每5 min翻一次面。染色結(jié)束后，棄TTC染液，將腦片固定在4%的多聚甲醛中。用數(shù)碼相機(jī)拍照，使用Image J軟件掃描圖片，并計(jì)算各組小鼠腦梗死體積占對(duì)側(cè)大腦體積的百分比。

1.7 TUNEL染色法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡

于腦缺血1 h，再灌注24 h后，取出小鼠大腦并在4%的多聚甲醛中固定。24 h后對(duì)腦組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，然后用二甲苯浸洗脫蠟，梯度乙醇浸洗2～3 min，滴加蛋白酶K在37℃條件下孵育15～30 min。滴加50 μL的TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育1 h。接著，滴加50 μL工作液并在37℃條件下孵育30 min，最后，加DAB染色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、透明、封片。正常細(xì)胞核被染成藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成深棕色。在顯微鏡下觀察小鼠大腦皮層區(qū)細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算TUNEL染色陽性率。TUNEL染色陽性率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 免疫印跡法檢測(cè)腦組織中p-STAT3、Bax、Bcl-2的表達(dá)

于腦缺血1 h，再灌注24 h后，立即處死小鼠并夾取缺血區(qū)腦組織，將腦組織置于玻璃研磨器中加入裂解液勻漿，收集蛋白勻漿到1.5 mL EP管中，冰上靜置裂解30 min。然后在4℃、12000 r/min的條件下離心30 min，取上清液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量。制備SDS-PAGE凝膠，將蛋白樣品上樣后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。封閉結(jié)束后用TPBS將膜洗3遍，每次4 min。隨后將PVDF膜分別與p-STAT3(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)一抗在4℃孵育過夜，第2天，用TPBS洗膜，加二抗孵育2 h。使用ECL顯影液使膜發(fā)光、顯影，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Bio Imaging System(Gene Genius)對(duì)圖像進(jìn)行灰度掃描分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEX可減輕腦I/R損傷所致小鼠神經(jīng)功能障礙

小鼠腦缺血1 h，再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果表明，sham組小鼠行動(dòng)正常，無神經(jīng)功能缺失現(xiàn)象；I/R組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(3.10±0.74)較sham組小鼠顯著升高(P<0.01)；DEX治療后，小鼠神經(jīng)功能有所改善，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(1.50±0.71)較I/R組降低(P<0.01)；在使用DEX的基礎(chǔ)上使用JAK2/STAT3抑制劑，DEX的保護(hù)作用減弱，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(2.80±0.79)較I/R+DEX組升高(P<0.01)。以上結(jié)果提示，DEX可減輕腦I/R損傷導(dǎo)致的小鼠神經(jīng)功能障礙，其作用機(jī)制可能與JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

2.2 DEX可減小腦I/R損傷小鼠腦梗死體積

采用TTC染色法檢測(cè)不同組小鼠的腦梗死體積，結(jié)果顯示(圖1)，sham組腦組織染色后呈紅色，無梗死區(qū)；I/R組染色后出現(xiàn)梗死區(qū)，梗死區(qū)染色呈白色。DEX治療后，小鼠腦梗死體積較I/R組明顯縮小(P<0.01)；而在使用DEX的基礎(chǔ)上加用JAK2/STAT3抑制劑，小鼠腦梗死體積較I/R+DEX組增加(P<0.01)。以上結(jié)果提示，DEX可以改善I/R造成的腦組織損傷，減小腦梗死體積。

**P<0.01圖1 DEX對(duì)腦I/R損傷小鼠腦梗死體積的影響Fig.1 Effects of dexmedetomidine on brain infarct volume of mice after cerebral I/R injury

2.3 DEX可減少小鼠腦組織細(xì)胞凋亡

用TUNEL染色法檢測(cè)不同組小鼠大腦皮層組織中細(xì)胞的凋亡情況。正常細(xì)胞染色呈藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞呈深棕色。結(jié)果顯示(圖2)，sham組存在少量凋亡細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生腦I/R損傷后，I/R組凋亡細(xì)胞顯著增多(P<0.01)；DEX治療后，與I/R組相比，凋亡細(xì)胞率顯著降低(P<0.01)；在使用DEX的基礎(chǔ)上加用JAK2/STAT3抑制劑，與I/R+DEX組相比，小鼠腦組織細(xì)胞凋亡顯著增多(P<0.01)。上述結(jié)果表明，DEX可以降低I/R損傷小鼠腦組織細(xì)胞的凋亡，其作用可能與JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

2.4 DEX可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路

為探究DEX對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響，用免疫印跡法檢測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路的活性成分p-STAT3和STAT3的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖3)，與sham組相比，I/R組p-STAT3/STAT3增加(P<0.01)；DEX治療后，與I/R組相比，p-STAT3/STAT3進(jìn)一步增加(P<0.01)；在使用DEX的基礎(chǔ)上加用JAK2/STAT3抑制劑后，與I/R+DEX組相比，p-STAT3/STAT3降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，在抗小鼠腦I/R損傷時(shí)，DEX可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路。

**P<0.01圖2 DEX對(duì)腦I/R損傷小鼠細(xì)胞凋亡的影響(×400)Fig.2 Effects of dexmedetomidine on cell apoptosis in mice with cerebral I/R injury(×400)

*P<0.05，**P<0.01圖3 DEX對(duì)腦I/R損傷小鼠p-STAT3/STAT3的影響Fig.3 Effects of dexmedetomidine on the ratio of p-STAT3/STAT3 in mice with cerebral I/R injury

2.5 DEX可影響腦I/R損傷后Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步探究JAK2/STAT3信號(hào)通路在DEX抗腦I/R損傷中的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖4)，與sham組相比，I/R組Bax/Bcl-2的比值顯著升高(P<0.01)；DEX治療后，與I/R組相比，Bax/Bcl-2的比值顯著降低(P<0.01)；在使用DEX的基礎(chǔ)上加用JAK2/STAT3抑制劑后，與I/R+DEX組相比，Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明，DEX抗腦I/R損傷的作用可能與激活JAK2/STAT3信號(hào)通路后降低Bax/Bcl-2比值有關(guān)。

**P<0.01圖4 DEX對(duì)腦I/R損傷小鼠Bax/Bcl-2比值的影響Fig.4 Effects of dexmedetomidine on the ratio of Bax/Bcl-2 in mice with cerebral I/R injury

3 討論

缺血性腦損傷是多種機(jī)制共同參與的一種復(fù)雜的病理生理過程，其機(jī)制涉及到能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[8-9]。目前臨床上治療缺血性腦損傷主要采用靜脈溶栓藥以及血管內(nèi)介入療法等措施恢復(fù)血液再灌注，但由再灌注造成的二次損傷是臨床面臨的又一項(xiàng)挑戰(zhàn)[10]。因此，探索治療腦I/R損傷的潛在治療藥物具有十分重要的臨床意義。DEX是臨床上廣泛使用的麻醉輔助用藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定圍術(shù)期血流動(dòng)力學(xué)等作用[11]。既往研究報(bào)道，DEX可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮器官保護(hù)作用，改善多種組織器官I/R損傷[4，12]。有臨床研究證實(shí)，DEX可通過PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路減輕大鼠心肌的I/R損傷[13]。在對(duì)糖尿病大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理通過上調(diào)HIF-1α減輕腎臟I/R損傷[14]。為了探究DEX對(duì)腦I/R損傷的作用機(jī)制，本研究通過線栓法構(gòu)建腦I/R損傷模型，I/R組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積百分比明顯增加，表明模型構(gòu)建成功。DEX進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積百分比均顯著低于I/R組，提示DEX對(duì)小鼠腦I/R損傷有保護(hù)作用。

腦I/R損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦I/R損傷的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠腦細(xì)胞TUNEL染色陽性率顯著升高，證明小鼠腦I/R損傷過程中存在細(xì)胞凋亡；而在使用DEX處理后，TUNEL染色陽性率明顯降低，再次表明DEX對(duì)腦I/R損傷小鼠的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用可能是通過抑制腦I/R損傷過程中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是一條高度進(jìn)化保守的信號(hào)通路，主要參與細(xì)胞對(duì)不同的細(xì)胞因子和生長因子的反應(yīng)，是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控凋亡和氧化應(yīng)激等反應(yīng)的重要途徑。STATs蛋白家族在JAK2/STAT3信號(hào)通路中發(fā)揮主要作用，其中STAT3比其他STAT蛋白具有更高的保守性，STAT3的激活可以指導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)揮抗凋亡和促增殖的作用[15]。在Zhao等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，激活STAT3抑制了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在腦I/R損傷的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活可以減輕腦損傷[17-18]。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠腦組織中p-STAT3/STAT3增加，我們分析這可能是由于機(jī)體自身的保護(hù)機(jī)制部分激活了JAK2/STAT3信號(hào)通路。而在使用DEX進(jìn)行治療后，p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯增加，表明DEX可以促進(jìn)JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，提示DEX可能通過JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，我們?cè)谑褂肈EX治療的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490進(jìn)行處理，在抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，與I/R+DEX組相比，小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積百分比、TUNEL陽性率均明顯增加，腦組織中p-STAT3/STAT3明顯降低。上述結(jié)果表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑顯著減弱了DEX的腦保護(hù)作用，提示DEX通過JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮對(duì)小鼠腦I/R的保護(hù)作用。

多項(xiàng)研究表明，腦I/R損傷過程中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡受到B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)蛋白家族的調(diào)控，這些蛋白在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要作用[19-21]。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax是參與線粒體介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子，兩者維持動(dòng)態(tài)平衡。越來越多的證據(jù)表明，在多種病理生理?xiàng)l件的刺激下Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，引起線粒體膜通透性改變，觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放并促進(jìn)凋亡小體的形成最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22-23]。因此，Bax/Bcl-2的比值也被用來衡量細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度。研究表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活可以通過降低Bax表達(dá)及增加Bcl-2的表達(dá)抑制細(xì)胞的凋亡[24-25]。我們猜測(cè)DEX通過JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡的作用也可能與Bax、Bcl-2有關(guān)，為了進(jìn)行驗(yàn)證，我們用免疫印跡法檢測(cè)了Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠腦組織中Bax/Bcl-2的比值顯著升高，在使用DEX處理后，Bax/Bcl-2的比值降低，在使用JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490后DEX對(duì)凋亡基因的調(diào)節(jié)作用被減弱，Bax/Bcl-2的比值有所升高。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DEX抗小鼠腦I/R損傷作用與激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，減少Bax/Bcl-2的比值，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為缺血性腦卒中患者圍手術(shù)期合理使用DEX提供了理論依據(jù)。