頭針聯(lián)合艾灸對缺血缺氧性腦損傷腦性癱瘓幼鼠記憶與學(xué)習(xí)能力及腦組織一氧化氮、谷胱甘肽過氧化物酶水平的影響※

周 鈺 李秀娟 劉 歡 鮑毅梅 周 光

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸推拿科，新疆 烏魯木齊 830011)

小兒腦性癱瘓(以下簡稱腦癱)是由于大腦先天性發(fā)育缺陷或獲得性腦損傷(如早產(chǎn)、缺血缺氧、感染等)所致，主要表現(xiàn)為運動障礙，伴或不伴感知覺及智力缺陷，已經(jīng)成為導(dǎo)致兒童神經(jīng)性殘疾中常見疾病之一[1-2]。目前，臨床上對于小兒腦癱的治療原則是早期診斷、早期干預(yù)、長期康復(fù)，利用各種綜合治療措施糾正異常的運動和姿勢，減輕傷殘程度，促進(jìn)患兒正常發(fā)育[3-5]。針灸療法在小兒腦癱的治療中發(fā)揮了重要作用，在改善腦癱患兒語言障礙，提高肢體功能，促進(jìn)患兒健康成長方面具有確切療效[6-8]。為進(jìn)一步探討針灸治療小兒腦癱的作用機(jī)制，我們通過建立缺血缺氧性腦損傷腦癱幼鼠模型，觀察頭針聯(lián)合艾灸對幼鼠記憶與學(xué)習(xí)能力的影響，以及幼鼠腦組織一氧化氮(NO)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)表達(dá)水平的變化，以明確其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)Wistar幼鼠120只，日齡7 d，體質(zhì)量25～30 g，雌雄不限，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心動物實驗室提供，實驗動物許可證號：SYXK(新)2018-0001。

1.2 實驗針具及艾條 0.18 mm×15 mm一次性不銹鋼毫針(貴州安迪藥械有限公司)；艾條選用清艾灸條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)。

1.3 主要實驗儀器及試劑 Morris水迷宮實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；GSH-Px檢測試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制作[9]

1.4.1.1 缺血手術(shù) 將幼鼠在乙醚密閉玻璃罐內(nèi)麻醉，消毒后在操作臺上固定，頸正中切口鈍性分離肌肉組織、迷走神經(jīng)，暴露左頸總動脈，用6-0號尼龍線結(jié)扎，離斷動脈后縫合消毒包扎，手術(shù)時間控制在5 min以內(nèi)，術(shù)后觀察2 h，無呼吸抑制、頸動脈出血等表示缺血造模成功。

1.4.1.2 缺氧過程 將缺血模型成功的幼鼠放入缺氧箱中(氮氣92%，氧氣8%)2.5 h，之后給予正常濃度氧氣供應(yīng)，并于1 h后做行為評定，以平衡異常、不能翻身初步判定是成功模型，3 d后各組幼鼠再進(jìn)行步伐失誤及平衡木測試，步伐失誤率明顯增加及平衡木試驗得分明顯增高，表示缺血缺氧造模成功。

1.4.2 治療方法 將缺血缺氧造模成功的120只幼鼠隨機(jī)分組為對照組、頭針組、艾灸組及聯(lián)合組，每組30只。

1.4.2.1 對照組 不給予任何治療措施。

1.4.2.2 頭針組 造模成功后第3 d開始行頭針針刺治療。①選穴：頭針頂顳前斜線(雙側(cè))與頂顳后斜線(雙側(cè))及百會。②定位：結(jié)合動物與人骨度類比，并參照《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[10]定位，頂顳后斜線于百會(頂骨的正中點)至曲鬢(耳緣和耳尖水平交點)連線[11]，頂顳前斜線于頂顳后斜線前0.1寸。③方法：穴區(qū)常規(guī)消毒，使用0.18 mm×15 mm一次性不銹鋼毫針，頭針從百會進(jìn)針，順從頂顳前、后斜線走行沿頭皮斜刺，百會沿頭皮向后針刺，深度4～5 mm，留針30 min，每日1次，共治療32 d。

1.4.2.3 艾灸組 造模成功后第3 d開始行艾灸治療。①選穴：夾脊(雙側(cè))、百會及足三里(雙側(cè))。②定位：結(jié)合動物與人骨度類比，并參照《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[10]定位，百會于頂骨的正中點，夾脊于脊柱旁開約3 mm，足三里于小鼠下肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨小頭下方約5 mm處。③方法：首先用固定器固定幼鼠，然后采用清艾條依次懸于穴位上方2 cm處(幼鼠較小，夾脊按1個穴上下往返灸治療)，采用溫和灸，每穴5 min左右，每日1次，共治療32 d。

1.4.2.4 聯(lián)合組 造模成功后第3 d開始行頭針聯(lián)合艾灸治療。選穴、定位及方法同頭針組及艾灸組。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 記憶與學(xué)習(xí)能力 采用Morris水迷宮實驗對幼鼠的記憶與學(xué)習(xí)能力進(jìn)行檢測[12]。Morris水迷宮實驗是迫使幼鼠游泳并使其學(xué)習(xí)尋找隱藏于水下的平臺，水池直徑1.5 m，水深30 cm，平臺位于迷宮的東北象限，平臺直徑12 cm，水面下5 cm，水溫22～25 ℃。各組幼鼠最后1次治療結(jié)束后開始訓(xùn)練，訓(xùn)練時設(shè)定最長游動時間為120 s，分別從正東、正南、正西、正北4個象限入水，完成4個象限的訓(xùn)練為1個循環(huán)，120 s后未找到平臺將引導(dǎo)其至平臺，并靜置30 s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。每只幼鼠每日實驗1次，共進(jìn)行5 d，前4 d為訓(xùn)練，第5 d為測試，記錄各組幼鼠的逃避潛伏期及游泳距離，逃避潛伏期為從入水到找到水下隱蔽平臺并站立其上所需的時間，游泳距離為從入水到找到水下隱蔽平臺的游泳總路程。

1.5.2 NO及GSH-Px檢測 各組幼鼠在做完Morris水迷宮實驗后腹腔注射水合氯醛麻醉，快速取出腦組織，分離兩側(cè)海馬區(qū)后固定于10%的中性福爾馬林液內(nèi)，-70 ℃保存。采用硝酸還原酶法測定海馬區(qū)NO水平，二硫代二硝基苯甲酸法測定海馬區(qū)GSH-Px水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠逃避潛伏期及游泳距離比較 見表1。

表1 各組幼鼠逃避潛伏期及游泳距離比較

由表1可見，頭針組、艾灸組及聯(lián)合組幼鼠逃避潛伏期及游泳距離與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均縮短。聯(lián)合組幼鼠逃避潛伏期及游泳距離與頭針組和艾灸組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組逃避潛伏期及游泳距離均短于頭針組和艾灸組。頭針組與艾灸組幼鼠逃避潛伏期、游泳距離組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組幼鼠海馬區(qū)NO及GSH-Px水平比較 見表2。

表2 各組幼鼠海馬區(qū)NO及GSH-Px水平比較

由表2可見，頭針組、艾灸組及聯(lián)合組幼鼠海馬區(qū)NO和GSH-Px水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NO水平降低，GSH-Px水平升高。聯(lián)合組幼鼠海馬區(qū)NO及GSH-Px水平與頭針組和艾灸組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組對NO及GSH-Px水平改善均優(yōu)于頭針組和艾灸組。頭針組與艾灸組幼鼠海馬區(qū)NO和GSH-Px水平組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

腦癱患兒缺血缺氧性腦損傷的基礎(chǔ)主要是窒息缺氧,導(dǎo)致腦內(nèi)血管的血液灌注和微循環(huán)交換的機(jī)制受損，腦組織發(fā)生缺血缺氧后可逐漸出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的不斷凋亡，當(dāng)?shù)竭_(dá)凋亡高峰以后，仍然沒有得到足夠的血液供給，不能抑制神經(jīng)細(xì)胞的繼續(xù)凋亡，就會造成局部腦組織壞死，進(jìn)而出現(xiàn)一系列神經(jīng)功能障礙，如果可以得到及時有效的干預(yù)措施,就有極大可能阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，更甚者逆轉(zhuǎn)凋亡，進(jìn)一步挽救神經(jīng)細(xì)胞，從而有效保護(hù)腦組織[13-14]。有研究表明，缺血缺氧性腦損傷發(fā)生后可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤，釋放出各種具有神經(jīng)毒性的物質(zhì)，如氧自由基、興奮性氨基酸、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，這也是發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞損害的主要原因[15-17]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，有效清除氧自由基，防止神經(jīng)細(xì)胞受到氧化損傷[18]。NO是大腦血管內(nèi)的神經(jīng)活性物質(zhì)，可以不同程度的調(diào)節(jié)血管張力，并且輔助細(xì)胞間的信息傳遞，研究表明腦缺血發(fā)生的12 h后，可在損傷部位的血管或神經(jīng)細(xì)胞里出現(xiàn)過量的NO，破壞微循環(huán)，這也是遲發(fā)性神經(jīng)元損傷的重要原因，另外在缺血缺氧性腦損傷發(fā)生后，NO還可與超氧自由基產(chǎn)生反應(yīng)，形成具有細(xì)胞毒性作用的亞硝酸陰離子和過氧亞硝酸鹽，對腦組織造成損傷[19-20]。

小兒腦癱屬中醫(yī)學(xué)五遲、五軟、五硬等范疇，其基本病機(jī)是腎精虧虛，氣血不足。明·徐春甫《古今醫(yī)統(tǒng)大全》中言：“有日月不足而生者，或服墜胎之劑不去而竟成胎者。耗傷真氣及降生之后，精氣不充，筋骨痿弱，肌肉虛瘦，神色昏慢，致使頭、項、手、足、身體軟弱，名為五軟。”認(rèn)為其病因為父母精血虛弱，先天之氣不充，導(dǎo)致胎氣不足，又后天失養(yǎng)，腦絡(luò)受損，臟腑功能失調(diào)，而發(fā)育異常。故治療應(yīng)以扶正益髓、溫經(jīng)通絡(luò)、益氣活血為原則?！端貑枴っ}要精微論》言：“諸陽之神氣皆上會于頭，諸髓之精氣皆上聚于腦，頭為精明之府。”“頭為諸陽之會?！惫饰覀冞x用頭針聯(lián)合艾灸治療。艾灸和頭針都是依據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說治病防病的常用方法，艾灸是借助艾火的溫?zé)嶙饔?，具有溫通氣血、扶正祛邪的功效，頭針則直接作用于腧穴，疏通經(jīng)絡(luò)，改善周圍氣血運行。夾脊位于背部脊椎兩旁，具有調(diào)整臟腑氣血的功能，《華佗別傳》有言：“又有人病腳躄不能行……后灸愈。灸處夾脊一寸上下行，端直均調(diào)如引繩也。”就是對艾灸夾脊穴治療腿腳運動功能障礙的記載。百會位于頭部巔頂，屬督脈，督脈又歸屬于腦，頭為諸陽之會，百脈之宗，而百會穴則為各經(jīng)脈氣會聚之處，所以艾灸和針刺百會，可通調(diào)全身經(jīng)脈，振奮陽氣，具有醒腦開竅、安神定志、升陽舉陷、益氣固脫的功效。足三里屬足陽明胃經(jīng)，胃的下合穴，傳統(tǒng)的保健要穴，脾胃為后天之本，艾灸足三里可生發(fā)胃氣，使氣血生化有源，具有補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪的功效，唐·王燾《外臺秘要》有言:“三里養(yǎng)先后天之氣,灸三里可使元氣不衰,故稱長壽之灸。”頂顳前斜線及頂顳后斜線則是根據(jù)現(xiàn)代頭針理論，其下有中央前回、中央后回以及旁中央小葉等，針刺治療可有效改善運動及感覺障礙[21]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，頭針組和艾灸組采用頭針和艾灸治療后均可明顯縮短幼鼠逃避潛伏期及游泳距離(P<0.05)，降低NO水平(P<0.05)，升高GSH-Px水平(P<0.05)，而聯(lián)合組采用頭針聯(lián)合艾灸治療具有明顯的協(xié)同增效作用，較頭針組和艾灸組，可以進(jìn)一步縮短幼鼠逃避潛伏期及游泳距離(P<0.05)，改善NO及GSH-Px水平(P<0.05)，艾灸溫補(bǔ)陽氣，頭針疏通經(jīng)絡(luò)，一補(bǔ)一通，使氣血開之有源，導(dǎo)之有流，從根本上改善了頭部氣血運行，促進(jìn)功能恢復(fù)。綜上所述，頭針聯(lián)合艾灸可明顯提高缺血缺氧性腦損傷腦癱幼鼠的記憶與學(xué)習(xí)能力，其作用機(jī)制可能與降低NO水平，升高GSH-Px水平，改善微循環(huán)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷有關(guān)。