鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎復(fù)合模型建立的研究進(jìn)展

馮源，王柳楊，任念念 綜述 葛頌 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000

牙周炎是一項(xiàng)牙周組織發(fā)生慢性破壞的感染性疾病[1]，本質(zhì)上是一種混合細(xì)菌感染，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落[2]。牙周炎是人類廣泛患有的疾病且發(fā)病率高，與全身系統(tǒng)性疾病息息相關(guān)[3]，其治療方案有待進(jìn)一步研究。適合的牙周炎動(dòng)物模型有助于研究人牙周炎的病因及病理改變，適用于研發(fā)藥物，最終運(yùn)用于臨床的疾病治療及預(yù)防中。

1 常用牙周炎模型動(dòng)物

靈長(zhǎng)類動(dòng)物的口腔構(gòu)成與人最為相似，其中猴與人各方面都有較高的相似度，其造成的牙周炎模型也最為接近。但因猴屬于自然保護(hù)動(dòng)物，價(jià)格昂貴且繁殖較慢，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用受到較大的限制[4]。

犬牙周炎模型與人相似，其中比格犬在國(guó)外應(yīng)用廣泛，但犬類品種間的差異較大，影響其易感性，且犬的攻擊性、飼養(yǎng)、病變程度和部位不均勻等特點(diǎn)也造成了其應(yīng)用受限[5]。

兔口腔微生物菌群分布與人類較為相似，因其臼齒為單根，較少用于牙周炎模型的建立，常用于骨相關(guān)的研究[6]。

小型豬在與全身性疾病相關(guān)的模型建立中效果上佳[7]，也是理想的自發(fā)性牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但價(jià)格較高、飼養(yǎng)復(fù)雜，目前應(yīng)用較少。

鼠飼養(yǎng)成本較低，有足夠的數(shù)量進(jìn)行研究和統(tǒng)計(jì)分析，生命周期短，適應(yīng)能力及抗病能力強(qiáng)，可快速誘發(fā)疾病，是目前應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物[8]。

2 鼠牙周炎復(fù)合模型的建立

2.1 牙周炎伴動(dòng)脈粥樣硬化鼠模型 心腦血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。牙周炎和動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)合模型通常采用兩個(gè)或者兩個(gè)以上相結(jié)合的方案。(1)高脂飲食+腹腔注射維生素D3+磨牙結(jié)扎+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型：任秀云等[9]對(duì)SD大鼠行一次性腹腔內(nèi)注射維生素D3，高脂飼料比例逐漸增大喂養(yǎng)，15周后免疫組化染色，成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型；絲線纏繞結(jié)扎絲再以“8”字結(jié)扎鼠的磨牙，定期口腔涂布牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)，15周后出現(xiàn)牙周炎臨床表現(xiàn)，成功建立牙周炎模型。張?jiān)疵鞯萚10]同上法注射維生素D3、高脂飼料喂養(yǎng)，免疫組化染色觀察動(dòng)脈血管壁，成功建立AS模型；絲線結(jié)扎雙側(cè)磨牙，每3周接種1次由4種牙周炎致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌的混懸液(P.g、A.a、F.n、P.i，1×109CFU/mL)于大鼠齦溝內(nèi)，建立牙周炎模型。大鼠臨床牙周檢查以及病理檢查顯示牙周炎動(dòng)物模型建立成功。(2)基因敲除小鼠+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型：CHUKKAPALLI等[11]采用4種牙周致病菌(P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia和F.nucleatum，2.5×109CFU/mL)口腔灌洗ApoE-/-小鼠，第24周時(shí)處死小鼠，以牙槽骨吸收情況確定牙周炎的形成，以病理檢查確定動(dòng)脈內(nèi)膜明顯斑塊形成，牙周炎動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建模成功。目前，AS模型建立中普遍應(yīng)用基因敲除小鼠，但以此建立牙周炎模型較為困難，因其牙齒小，口內(nèi)結(jié)扎操作極為不便且效率較低；研發(fā)出基因敲除大鼠或其他較大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將更有利于日后的模型建立及研究[12]。

2.2 糖尿病 糖尿病為一項(xiàng)廣泛存在的長(zhǎng)期、慢性疾病，現(xiàn)普遍認(rèn)為，糖尿病與牙周炎之間的關(guān)系是雙向的，即一種疾病的存在往往會(huì)增加另一種疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重性，反之亦然[13]。牙周炎和糖尿病復(fù)合模型通常采用多種相結(jié)合的方案。(1)高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素+正畸絲結(jié)扎+絲線結(jié)扎結(jié)扎復(fù)合模型：高脂飼料加10%高糖水喂養(yǎng)大鼠兩周，之后行腹腔注射鏈脲佐菌素(40 mg/kg)，血糖高于16.7 mmol/L，糖尿病建模成功；糖尿病牙周炎組用絲線纏繞結(jié)扎絲置于磨牙頸部，5 d后有明顯的牙周炎臨床癥狀，可見(jiàn)牙根暴露[14]，判斷牙周炎造模成功。(2)自發(fā)性T2DM大鼠模型+磨牙結(jié)扎+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型：OLETF為自發(fā)性T2DM大鼠，LETO為其對(duì)照組；通過(guò)制作4種牙周病原體的混懸液，將絲線浸泡后進(jìn)行磨牙結(jié)扎，并每隔四周口內(nèi)行牙周致病菌混懸液涂抹，20周后處死所有大鼠，micro-CT和病理切片確定其牙周炎形成[15]。OLETF大鼠作為優(yōu)秀的T2DM動(dòng)物模型，結(jié)合涂菌的絲線結(jié)扎能成功建立牙周炎模型。糖尿病常用藥物鏈脲佐菌素等誘導(dǎo)產(chǎn)生，其操作方便，成功率較高，但不一定反映的是T2DM真實(shí)本質(zhì)的病理狀態(tài),因而影響研究結(jié)果的可靠性。OLETF大鼠臨床表現(xiàn)和病理變化與人類T2DM極為相似。是目前國(guó)際上公認(rèn)的最理想的2型糖尿病的動(dòng)物模型之一。但其費(fèi)用較高，購(gòu)買過(guò)程較繁瑣，臨床尚需更合適的動(dòng)物模型。

2.3 阿爾茨海默癥(Alzheimers disease，AD) 阿爾茨海默癥是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，腦組織中的β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過(guò)度磷酸化、神經(jīng)元丟失及炎癥反應(yīng)為特征性病理改變。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)牙周炎是阿爾茨海默癥的危險(xiǎn)因素，牙周致病菌如牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌等已在腦脊液及神經(jīng)節(jié)中獲得分離，致病菌將自身毒性及產(chǎn)出的毒力因子直接作用于腦內(nèi)[16]。牙周炎和阿爾茨海默復(fù)合模型方案如下：(1)APP轉(zhuǎn)基因小鼠+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型：從J20品系獲得雌性半合子轉(zhuǎn)基因小鼠(hAPP-J20)和非轉(zhuǎn)基因小鼠(WT)；于小鼠口內(nèi)齦邊緣涂布含牙齦卟啉單胞菌的羧甲基纖維素，對(duì)照組僅涂布同量羧甲基纖維素。11周后micro-CT和組織病理學(xué)檢測(cè)其牙周炎模型造模成功，通過(guò)新奇物識(shí)別實(shí)驗(yàn)對(duì)其認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，判斷其AD形成[17]。(2)誘導(dǎo)Aβ沉積+磨牙結(jié)扎復(fù)合模型：麻醉雄性SD大鼠，固定其于立體定位儀中，注射Aβ25-35于海馬體附近，縫合切口，絲線纏繞鋼絲結(jié)扎大鼠上頜雙側(cè)第二磨牙。飼養(yǎng)一段時(shí)間后，水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)顯示實(shí)驗(yàn)組學(xué)習(xí)和記憶能力較差；光學(xué)顯微鏡觀察H＆E染色的腦組織切片，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組海馬CA3區(qū)受損神經(jīng)元的數(shù)量較高，出現(xiàn)磨牙明顯的牙周臨床癥狀，AD及CP模型造模成功[18]。目前阿爾茨海默病病因的假說(shuō)和理論較多，尚無(wú)定論，因此動(dòng)物模型的方法尚多，能在不同方面印證某一假說(shuō)或理論，但目前沒(méi)有一項(xiàng)動(dòng)物模型及造模方法可完全模擬人類的老齡化過(guò)程及阿爾茨海默病發(fā)生過(guò)程中的病理變化。分析不同模型特點(diǎn)及其表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，從不同致病機(jī)制綜合分析多項(xiàng)模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠更真實(shí)地追溯阿爾茨海默病的病因。

2.4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥發(fā)生以及周圍硬組織的破壞為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病[19]。關(guān)節(jié)炎與牙周炎都有遺傳學(xué)背景,相似病理過(guò)程表現(xiàn)為病變部位的慢性炎癥并伴隨骨的吸收和破壞。牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA+口腔接種牙周致病菌復(fù)合模型：7周齡，體質(zhì)量18~20 g DBA/1型雄性小鼠分為單純膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組(CIA)和P.g感染+膠原誘導(dǎo)RA組(CIA+P.g)。CIA：口腔內(nèi)涂抹2%羧甲基纖維素；CIA+P.g：口腔內(nèi)2 d一次接種含牙齦卟啉單胞菌(P.g)的羧甲基纖維素，1周后膠原誘導(dǎo)RA：尾部注射0.1 mol/L(膠原：100μg)乳劑。免疫后10 d行二次加強(qiáng)免疫，小鼠出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)腫脹，RA建模成功[20]。上述提到的各種復(fù)合模型的建立受時(shí)間、操作便捷性等影響，方法數(shù)目有限。但單一模型的建立方法仍有許多，文中尚未提及，是否能組合成為新的復(fù)合模型建立方法仍有待探索。

2.5 不同品系鼠的造模差異 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的常用品系為Wistar大鼠、Got-Kakizaki(GK)大鼠、Brown-Norway(BN)大鼠、Sprague-Dawley(SD)大鼠[21]，口腔常用為Wistar大鼠和SD大鼠，其造模后呈現(xiàn)的效果不盡相同。周穎芳等[22]分別用SD大鼠和Wistar大鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)構(gòu)建關(guān)節(jié)炎模型(CIA)，炎癥指數(shù)評(píng)分和病理改變均顯示SD大鼠關(guān)節(jié)炎癥重于Wistar大鼠，提示在建立CIA復(fù)合模型時(shí)可優(yōu)先選擇SD大鼠。董亞南[23]在SD、Wistar大鼠最大攝氧量的增齡特征與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的定量化研究中發(fā)現(xiàn)相同年齡階段Wistar大鼠運(yùn)動(dòng)能力表現(xiàn)優(yōu)于SD大鼠，品系選擇對(duì)AD大鼠的行為學(xué)試驗(yàn)表現(xiàn)、COPD大鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果的影響應(yīng)納入考慮范圍。郭學(xué)軍等[24]腹腔注射STZ分別建立SD、Wistar大鼠糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠，選用中劑量(55 mg/kg)給藥則可以有效提高SD大鼠成模率，降低其死亡率；陳楓等[25]則發(fā)現(xiàn)以35 mg/kg給藥可增高Wistar大鼠的成模率，其結(jié)果優(yōu)于SD大鼠。呂曉君等[26]用改進(jìn)的高熱量飼料建立了SD和Wistar大鼠肥胖模型，品系間未見(jiàn)明顯差異。C57BL/6J小鼠較ICR和KM更能形成良好肥胖模型[27]。通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)方式分別給予Balb/c、C57BL/6，后者更易產(chǎn)生具有差異的體質(zhì)量增加；在糖代謝方面，前者出現(xiàn)代謝功能異常，而后者則無(wú)[28]。上述結(jié)果對(duì)建立糖尿病復(fù)合模型或動(dòng)脈粥樣硬化復(fù)合模型具有一定參考意義。

3 鼠牙周炎相關(guān)模型的建立

非正常的咬合接觸關(guān)系或者咬合力過(guò)大導(dǎo)致的咀嚼系統(tǒng)各部位的病理性損害或者適應(yīng)性變化被稱為咬合創(chuàng)傷[29]，咬合創(chuàng)傷可作為一項(xiàng)獨(dú)立疾病，也可作為牙周炎的一個(gè)重要的局部促進(jìn)因素，尚無(wú)定論。其造模方法如下：(1)降低兩邊牙齒咬合+絲線結(jié)扎法復(fù)合模型：BUDTZ-J?GENSEN等[30]適量磨去雄性Wistar大鼠第二、第三磨牙的牙尖，以不引起牙髓炎、不暴露牙髓為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)造成雙側(cè)第一磨牙咬合力過(guò)大；選取任一側(cè)下頜第一磨牙頸部棉線結(jié)扎,另一側(cè)不做處理。30 d后牙周炎合并創(chuàng)傷模型建立。組織學(xué)顯示根分叉病變，牙槽骨嵴頂明顯降低。(2)放置高嵌體+脂多糖注入牙齦法復(fù)合模型：YOSHINAGA等[31]于大鼠牙齦左下第一磨牙齦溝內(nèi)注入脂多糖形成牙周炎模型，然后在對(duì)牙放置一高嵌體，致使左下第一磨牙形成創(chuàng)傷，成功形成牙周炎合并咬合創(chuàng)傷的復(fù)合模型。(3)螺紋釘+Keyes2000牙周炎飼料加自身糞便水喂養(yǎng)復(fù)合模型：大鼠左側(cè)上頜第一磨牙面中央窩處用車針形成一孔，再植入螺紋釘，使其高出面0.6~0.8 mm，以此造成對(duì)創(chuàng)傷。病理切片結(jié)果中對(duì)牙根、牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目及牙槽嵴高度降低情況顯示其牙周炎狀況，對(duì)此進(jìn)行分析[32]。

4 結(jié)語(yǔ)

牙周炎作為一項(xiàng)廣泛發(fā)生的疾病，威脅著人類的健康。以鼠為模型，對(duì)牙周炎的致病機(jī)制、牙周炎與其他疾病的關(guān)系進(jìn)行研究，獲得了大量的數(shù)據(jù)和新的進(jìn)展。但鼠的口腔微生物和人口腔微生物不同，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步的分析及臨床試驗(yàn)的支持。以鼠為模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)或推翻了研究者的部分設(shè)想，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究牙周病的發(fā)生發(fā)展、其與全身疾病的關(guān)系、臨床治療等方面提供了新的思路和方向，也是牙周醫(yī)學(xué)的發(fā)展的重要推動(dòng)力之一，實(shí)驗(yàn)性牙周炎鼠模型的研究也將繼續(xù)發(fā)揮其重要作用。