P-糖蛋白與宮頸癌順鉑化療耐藥關系及相關機制的研究進展

葉鑫鑫，王亞軍 綜述 周航 審校

遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腹部腫瘤科，貴州 遵義 563000

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是最常見的女性腫瘤死亡原因之一。2018年對全球癌癥進行的統(tǒng)計數(shù)據可見：宮頸癌是全球女性人群中發(fā)病率和死亡率排第二的腫瘤[1]。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的感染是其主要的發(fā)病原因，它會引起婦女宮頸上皮內瘤變和宮頸癌的發(fā)生。目前發(fā)達國家中宮頸癌的數(shù)量已較前明顯減小，但在發(fā)展中國家，宮頸癌的數(shù)量仍在上升，死亡率也隨之增加[2]。手術和放化療一直是宮頸癌主要的治療手段，早期患者主要以手術為主，中晚期患者大多通過放化療治療。晚期或復發(fā)轉移性宮頸癌患者一般采用單純化療法，但因為化療耐藥現(xiàn)象越來越普遍，所以化療藥物的療效和應用大打折扣，使得治療效果不佳甚至失敗，這類患者一年生存率僅為10%~20%[3]，所以宮頸癌化療耐藥的難題長期困擾著臨床工作者們。

順鉑作為經典的宮頸癌化療藥物，于1845年首次被發(fā)現(xiàn)并制備出來，后對該藥物的測試發(fā)現(xiàn)其對多種動物腫瘤均有效。宮頸癌的化療建議采用單用順鉑或是含順鉑方案的聯(lián)合化療。但是，天然耐藥和后天耐藥都極大地削減了順鉑對腫瘤的治療作用。順鉑抗腫瘤作用的分子機制主要為與作用細胞的DNA形成DNA-順鉑復合物，進而引起其作用細胞的DNA損傷。當順鉑誘導的DNA損傷無法修復時，細胞就會發(fā)生凋亡并死亡。其中P-糖蛋白(P-gp)在影響順鉑發(fā)揮抗腫瘤的作用過程中起著重要的作用，也是目前在順鉑耐藥原因中研究的較多的一個蛋白分子。

1 P-gp簡介

P-gp即P-糖蛋白，是由多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的首個人體ABC(ATP結合盒)轉運蛋白，它屬于依賴ATP的跨膜轉運蛋白質。人體的P-gp氨基酸殘基多達1 280個，有著170 kD的相對分子量[4]。它大量存在于身體的五臟六腑中，包括大腦、腎臟、睪丸、腎上腺素、肝臟、子宮、腸組織、卵巢、胎盤等正常人體器官內，身體中各種內、外源性物質的吸收、代謝和排泄都與之相關，對維持機體穩(wěn)態(tài)有著關鍵意義。許多腫瘤中都存在它過表達的現(xiàn)象，比如常見的一些癌癥，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和宮頸癌等，大量的研究表明P-gp與腫瘤的化療耐藥關系緊密。

高國蘭等[5]基于免疫組化法對51個宮頸癌組織和9個正常宮頸組織進行了相應的檢測，涉及其中的P-gp、GST-π和TS蛋白的表達區(qū)別，結果發(fā)現(xiàn)51個宮頸癌組織P-gp蛋白陽性表達率達到45.10%(23/45)。隨后的曾四元等[6]對宮頸癌組織中P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ的表達及意義探索時發(fā)現(xiàn)P-gp表達現(xiàn)象還存在于正常宮頸、宮頸上皮內瘤變(CIN)、初治宮頸癌和復發(fā)癌組織里，它們的表達強弱排序如下：正常宮頸組織最低，其次是CIN，初治宮頸癌又大一些，最高的是復發(fā)宮頸癌組織。P-gp低、高表達組三年生存率依次為93.3%和63.3%，隨之做出如下猜想：P-gp表達上升不但會作用于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，也會對宮頸癌的預后產生影響。郭慈仁等[7]對P-gp、GST-π和TopoⅡ在巨塊型宮頸癌中的表達和與新輔助化療的關聯(lián)一并進行了探索研究，并且得出了結論：P-gp不光在新輔助化療組，在單純手術組中也會有表達，這種現(xiàn)象猜測是腫瘤細胞天然耐藥的證據，所以對于腫瘤細胞有原發(fā)性耐藥現(xiàn)象的論述是贊同的。繼而發(fā)現(xiàn)P-gp在新輔助化療后的表達率和單純手術組相比增高，這個發(fā)現(xiàn)證明化療能夠使得耐藥分子發(fā)生表達轉變，從而導致后天耐藥，也就是獲得性耐藥。該團隊還發(fā)現(xiàn)新輔助化療組中P-gp表達陽性組的化療有效率遠遠小于表達陰性組的有效率。以上發(fā)現(xiàn)表明，P-gp在宮頸正常組織和腫瘤組織中都普遍存在，但在腫瘤組織中的表達大于正常組織。因此P-gp的高表達是引起化療耐藥的關鍵因素。

2 P-gp介導的宮頸癌順鉑耐藥機制

2.1 P-gp導致化療藥物的外排增加 既往已有大量研究表明，5"-三磷酸腺苷(ATP)結合盒(ABC)轉運蛋白可能通過增加順鉑外排介導順鉑耐藥，ATP結合盒轉運蛋白包括多藥耐藥蛋白(MRP)一系列：MRP1、MRP2、MRP3和MRP5在內。MRP1過表達已被發(fā)現(xiàn)在一些宮頸癌細胞中與宮頸癌順鉑耐藥相關聯(lián)。下文所述研究表明，宮頸癌順鉑耐藥株SiHaR中MRP1和P-gp1的過表達使宮頸癌細胞產生耐藥性。比如姜黃素作為MRP1和P-gp1的抑制劑應用于耐順鉑的宮頸癌細胞中后，結果對比未加入姜黃素組顯著減少了順鉑的化療劑量，化療藥物對腫瘤細胞的敏感性得到了增強[8]。童文娟等[9]在P-gp對宮頸癌化療耐藥影響及耐藥分子機制方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞在含依托泊苷的培養(yǎng)基中在較短時間內會導致細胞內依托泊苷藥物含量上升，抑制或提升P-gp活性對細胞內藥物含量不產生相關作用。表明P-gp對依托泊苷的攝入過程沒有相關作用，而在持續(xù)培養(yǎng)細胞過程中，細胞內依托泊苷含量表現(xiàn)出了減小趨勢，這個時候當P-gp活性再次被抑制時，此時細胞內的藥物濃度恒定，證實P-gp參與依托泊苷的泵出過程。因此，他們的研究充分說明了P-gp導致化療藥物的外排增加。

2.2 P-gp參與凋亡抑制 P-gp介導的耐藥性并不僅僅只有增加藥物外排這一原因，這種蛋白也參與很多凋亡抑制的過程，尤其是通過抑制凋亡信號通路和或抑制凋亡信號因子，導致腫瘤細胞耐藥。TAINTON等[10]進行了試驗，發(fā)現(xiàn)突變過的P-gp不再具有泵出藥物的活性，但對胱天蛋白酶(凋亡作用酶)的激活還存在著抑制作用，得到結論：P-gp耐藥不是只靠其藥物外排作用，在凋亡抑制中發(fā)揮影響亦是引起腫瘤細胞耐藥的關鍵因素。還有一種發(fā)現(xiàn)是：P-gp在抑制胱天蛋白酶-3、激活胱天蛋白酶-8中有一定的效力，從而對細胞的凋亡產生抑制作用，進一步使得細胞耐藥形成[11]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子家族中的一員，可誘導多種腫瘤細胞凋亡。GALSKI等[12]研究表明，P-gp表達與TRAIL介導的凋亡相關，并且P-gp的活性是能夠逆轉TRAIL介導凋亡的關鍵，也證明了P-gp具有抗凋亡作用。Survivin蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的最強凋亡抑制因子，已有多種研究證實它在宮頸癌組織中高表達。WANG等[13]在對宮頸癌紫杉醇耐藥株進行實驗時發(fā)現(xiàn)，宮頸癌紫杉醇耐藥株有著明顯的耐藥性，與親本株相比，其P-gp和谷胱甘肽硫轉移酶顯著增加，與抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的高表達顯著正相關，是腫瘤組織化療失敗的重要原因。于春霞等[14]研究了50例宮頸癌患者，得到結果：宮頸癌新輔助化療后Survivin表達的陽性率(34.00%)相比于化療前(78.00%)小許多?；谏鲜鲅芯浚惙业萚15]通過制定P-gp、MRP1、Survivin在宮頸鱗癌新輔助化療前后的表達差異和對臨床療效的預測作用研究中得出結果：化療后Survivin的表達量顯著低于化療前水平，且新輔助化療有效組Survivin的表達量顯著低于化療無效組，同時P-gp的表達水平與Survivin呈正相關。綜上可見P-gp可通過抑制凋亡信號通路和或抑制凋亡信號因子發(fā)揮抗凋亡作用，進一步導致癌細胞對化療藥物耐藥。

2.3 P-gp參與腫瘤細胞免疫調節(jié)功能 P-gp與腫瘤免疫細胞的表達、活化、表型轉換和細胞因子釋放有關。比如P-gp在外周血單核細胞中的表達很少，但在腫瘤浸潤抗炎MΦ2組織巨噬細胞中的表達極高[16]。在所有天然免疫細胞中，自然殺傷(NK)細胞的P-gp表達水平最高，同時P-gp的表達調控了下游細胞毒性功能，對炎性毒性細胞分泌顆粒的形成和釋放產生作用，直至調控靶細胞死亡。P-gp在適應性免疫調節(jié)細胞中的功能因細胞類型而異。在B細胞中，P-gp的表達與細胞遷移和淋巴結移行表型有關。在CD4+T細胞中，P-gp與炎性Th1/Th17效應細胞表型相關，而在抗炎Treg表型中表達極則很少[17]。目前已有很多研究發(fā)現(xiàn)，惡性血液系統(tǒng)疾病患者免疫細胞中的P-gp表達水平明顯上升，比如多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤在內的等等，所以這些腫瘤常常對化療產生抗藥性[18]。值得注意的是，以單克隆抗體(MAb)為基礎的抗CD20和抗CD19的靶向治療可以克服P-gp介導的化療耐藥性，有研究指出可能原因是因為MAb不能被P-gp排出胞外[19]。關于P-gp與細胞免疫對宮頸癌化療耐藥是否有確切的相關性尚沒有特別的研究報道，但免疫細胞存在于每個人體內，與個體健康息息相關，所以P-gp參與腫瘤細胞免疫調節(jié)功能這一方面對于宮頸癌化療耐藥機制來說也是一個未來可研究的方向。

2.4 P-gp與非編碼RNA 非編碼RNA屬于功能性RNA分子，不能翻譯為蛋白質，對基因的轉錄翻譯起著重要的調節(jié)作用，即不包括mRNA、tRNA和rRNA的其他RNA分子。這其中有一種微小RNA(microRNA，miRNA)，它能夠調控體內多種基因的轉錄，還能對基因轉錄后mRNA的翻譯過程產生抑制作用。MiRNA普遍存在于生物體內，其結合對應的靶基因mRNA 3"端非編碼區(qū)(3"-UTR)后，能夠降解靶基因的mRNA或抑制轉錄后的翻譯過程。P-gp的表達可以受到miRNA的直接作用，也可因為某信號通路被miRNA所干擾影響P-gp的表達從而引發(fā)腫瘤細胞耐藥。劉昀昀等[20]及其團隊研究表明，增強宮頸癌Hela、Siha細胞株中miR100的表達水平對腫瘤細胞的侵襲活力有明顯抑制作用，同時Hela、Siha宮頸癌細胞對順鉑的敏感性也隨之增強。魯燕飛等[21]及其團隊也對宮頸癌組織中miR100的表達量和順鉑耐藥的關系進行了研究，他們把宮頸癌組織分成兩組，即順鉑敏感組和耐藥組，分別檢測兩組宮頸癌組織中miR100表達量，發(fā)現(xiàn)miR100在順鉑敏感組宮頸癌組織中的表達量比順鉑耐藥組高很多，此外，他們發(fā)現(xiàn)Nek2、P-gp、GSTGπ、TopoGⅡ在順鉑敏感的宮頸癌組織中的表達比順鉑耐藥的宮頸癌組織小很多，且miR100表達水平相對于Nek2、P-gp、GSTGπ、TopoGⅡ的表達量呈負相關。由此得出結論：宮頸癌組織內miR100表達過低會引發(fā)多藥耐藥基因的表達上升進而使得腫瘤細胞耐藥性升高。MAO等[22]在84例宮頸癌患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織標本中檢測LINC0051的表達，探討長鏈非編碼RNA(lncRNA)LINC00511在Hela/PTX(宮頸癌紫杉醇耐藥細胞)增殖、凋亡以及對紫杉醇耐藥過程中的作用。結果發(fā)現(xiàn)沉默LINC00511表達后，Hela/PTX中MRP1、P-gp、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達降低，而Bax和Caspase-3凋亡酶的表達增加，此外，沉默LINC00511可以抑制細胞對紫杉醇的耐藥性，且可以促進抗PTX細胞凋亡。抑制LINC00511的表達為化療耐藥宮頸癌患者提供了新的治療靶點。

2.5 與調節(jié)P-gp有關的信號傳導通路 信號傳導通路連接著細胞外信號刺激因子與細胞內信號傳輸系統(tǒng)，在腫瘤多藥耐藥過程中有關鍵的影響，大量的信號傳導通路在P-gp介導的多藥耐藥過程中有著不可磨滅的作用。對P-gp表達有關的信號通路研究具體有：NF-κB、MAPK、PI3、ERK1/2、COX-2、ROS、Wnt/β-catenin通路等。例如，王勁歐等[23]在ER和MDM2及ERK1/2信號通路與卵巢癌細胞耐受抵抗藥物有無相關性的研究中證實，ERK1/2酶在卵巢癌耐藥細胞中的活力非常高，是非耐藥細胞的1.5倍，其中ERK1/2激酶活性和MDM2的表達都和P-gp的表達是正相關關系。而在有關宮頸癌耐藥研究中，ZHAO等[24]發(fā)現(xiàn)，下調宮頸癌SiHa細胞中S100A9基因可顯著提高SiHa細胞的凋亡率，從而提高其對順鉑的敏感性，其機制可能與Bcl-2、GST-π和LRP蛋白的表達及AKT/ERK-FOXO1-Nanog信號通路的改變有關。DUAN等[25]在宮頸癌SiHa順鉑耐藥細胞中發(fā)現(xiàn)，PSAT1通過阻斷PI3K/Akt信號通路抑制SiHa順鉑耐藥細胞增殖和誘導細胞凋亡，從而降低SiHa順鉑耐藥細胞細胞對順鉑的耐藥性。劉昀昀等[26]發(fā)現(xiàn)，經過放療誘導的耐放療宮頸癌Hela、Siha細胞系中，經典Wnt通路分子下游基因C-Myc、Cyclin D1表達呈上升趨勢，這就使得檢測后發(fā)現(xiàn)這個細胞中ABCB1、ABCG2表達也有所增加。張彥等[27]隨后進行的一項探索發(fā)現(xiàn)，硫利達嗪對Wnt通路的活性具有抑制作用，同時Hela/DDP(耐順鉑宮頸癌細胞)中耐藥蛋白(P-gp和MRP1)也明顯降低?？偨Y兩項研究，得出Wnt/β-catenin可能直接或間接的升高宮頸癌順鉑耐藥細胞中的P-gp表達，從而使腫瘤細胞耐藥。

3 展望

晚期或復發(fā)轉移性宮頸癌的主要治療方式仍然是化療，主要是通過單用順鉑或含順鉑方案的聯(lián)合化療，但順鉑化療的耐藥性使得這部分患者總生存時間有很大的削減。本文綜述了P-gp對宮頸癌化療耐藥的作用及相關機制的探索進展。針對P-gp導致的化療耐藥，已有大量研究正在嘗試改善這一現(xiàn)狀。其克服耐藥的策略基本圍繞以下這些方面來展開：(1)對能逆轉耐藥性的天然化合物的挖掘及現(xiàn)有化合物的結構進行改造使其對耐藥分子的抑制性有更強的活力及特異性；(2)對現(xiàn)有抗腫瘤藥物進行改造使其能多靶點攻擊腫瘤細胞，降低其耐藥的可能性；(3)將各種抗癌藥物與一氧化氮供體組合使其藥物不光有抗癌作用還能持續(xù)提供高濃度NO：因持續(xù)高濃度NO能通過多種機制延緩腫瘤的進展，并能誘導腫瘤細胞凋亡，抵抗耐藥，抑制轉移的發(fā)生[28]；(4)將各種抗癌藥物與吖啶類衍生物結合克服藥物耐藥：既往研究證明吖啶類衍生物與抗腫瘤藥物合用能顯著提升使用抗癌藥物后期的細胞毒性作用[29]；(5)將部分抗腫瘤藥物糖基化：糖基化的抗癌藥物有更強的細胞毒性同時其耐藥性比未糖基化藥物發(fā)生得更晚[30]；(6)通過現(xiàn)代生物信息技術預測耐藥分子結構、分析其藥代動力學、生物利用度等，攻擊其結構上與腫瘤細胞的最佳結合位點，特異性降低耐藥分子的活性。而以P-gp抑制劑為主的藥物主要有以下四代：第一代有以下六種，包括一鈣離子拮抗劑、二鈣通道阻滯劑、三免疫抑制劑、四蛋白激酶C抑制劑、五抗生素和六表面活性劑等等。第一代中以維拉帕米、環(huán)孢菌素A作為經典藥物代表。但第一代抑制劑對P-gp的親和力低，毒性大，臨床應用少之又少。通過對第一代抑制劑結構的改進，衍生了第二代抑制劑，如右維拉帕米、代司樸達和比立考達等藥物，較之第一代，與P-gp親和力更強、毒性小、效果更佳[31]。然而，由于其他ABC轉運蛋白抑制劑和細胞色素P450酶抑制劑的大量應用，這些藥物抑制劑與P-gp抑制劑之間藥物靶點存在重疊，遂其藥代動力學受到相互影響，限制了第二代的臨床應用[32]。隨著定量構效關系學(QSAR)及組合化學的發(fā)展，高選擇性和更有效的第三代P-gp抑制劑產生了，主要有以下三種：一是苯甲酰亞胺衍生物、二是環(huán)丙基二苯丙環(huán)庚烷類物質、三是替代二芳基咪唑的衍生物等。第三代能特異性和P-gp結合導致其獨特的藥物外排作用損傷，使得細胞內化療藥物濃度提升，扭轉多藥耐藥的發(fā)生。即使第三代抑制劑優(yōu)于第一代和第二代藥物，但在Ⅲ期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)其仍存在有不同程度的毒性反應，且對患者的死亡率沒有顯著影響，所以第三代抑制劑的進一步發(fā)展也受到了限制[33]。這也就導致了第四代抑制劑被開發(fā)出來，包括：(1)從植物或自然環(huán)境中分離的化合物及其衍生物；(2)擬肽；(3)雙配體(能夠抑制P-gp和另一種MDR的化合物)[31]。還有酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)[34]、免疫抑制劑、類固醇衍生物、中藥以及利用小分子RNA干擾P-gp的轉錄，從而抑制P-gp的過表達以阻斷多藥耐藥現(xiàn)象等等，以及其他新型藥物及技術正在不斷被世界各地的學者所研究。當然，根據既往研究結果，筆者知道對于P-gp介導的宮頸癌順鉑耐藥只是宮頸癌化療耐藥眾多機制中的一個方面，不能只針對一種耐藥機制做出克服策略，要知道，引起宮頸癌順鉑或多藥耐藥的機制非常復雜，代表各位臨床科研工作者需協(xié)調多種因素共同調控。鑒于臨床中宮頸癌順鉑和或其他藥物多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生越來越普遍，這個問題的解決變得迫在眉睫。研發(fā)新的基因治療或藥物治療對于逆轉腫瘤多藥耐藥意義重大，但同樣重要的是確保腫瘤多藥耐藥抑制劑在臨床治療中的使用更安全有效。