液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中2種植物生長調(diào)節(jié)劑

崔敏

摘 要：目的：建立了豆芽中4-氯苯氧乙酸（4-CPA）和6-芐基腺嘌呤（6-BAP）的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定方法。方法：豆芽樣品經(jīng)酸化乙腈提取，LC-C18柱凈化后，以甲醇和含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸的流動相，經(jīng)C18色譜柱分離，在UPLC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果：在10～200 ng/mL，

2種植物生長調(diào)節(jié)劑有良好線性關(guān)系（R2≥99.7%），回收率為84.3%～94.6%，精密度為2.6%～10.3%，4-CPA的檢出限和定量限分別為1.54 μg/kg和4.28 μg/kg，6-BAP的檢出限和定量限分別為0.237 μg/kg和0.459 μg/kg。結(jié)論：該方法前處理簡單快速、線性良好，回收率和精密度高，可以準(zhǔn)確測定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，滿足國內(nèi)外豆芽中對4-CPA和6-BAP限量的檢測需求。

關(guān)鍵詞：豆芽;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;植物生長調(diào)節(jié)劑;4-氯苯氧乙酸;6-芐基腺嘌呤

Determination of Two Plant Growth Regulators in Bean Sprouts Using Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

CUI Min

（Rongcheng Inspection and Testing Center， Rongcheng 264300， China）

Abstract： Objective： To develop a determination method for 4-chlorophenoxyacetate （4-CPA） and 6-benzyl Adenine （6-BA） in bean sprouts by liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Method： the samples were extracted using acidified acetonitrile， and purified through an LC-C18 SPE column. Then the sample solution was separated on a C18 chromatographic column with gradient elution using methanol and 0.1% formic acid containing 5 mmol/L ammonium acetate as the mobile phase， and detected by HPLC-MS/MS under the multiple reaction monitoring（MRM）. Result： The two plant growth regulators in range of 10～200 ng/mL with good line （R2≥99.7%）. The recoveries ranged from 84.3% to 94.6%， and the RSD was 2.6%～10.3%. The limits of detection and quantification for 4-CPA were 1.54 μg/kg and 4.28 μg/kg， and for 6-BaP were 0.237 μg/kg and 0.459 μg/kg， respectively.? Conclusion： This method is simple and rapid， with the advantages of good linearity， high recovery and precision. It can accurately determine the contents of 4-CPA and 6-BaP in bean sprouts， and meet the requirements of 4-CPA and 6-BAP detection in bean sprouts at home and abroad.

Keywords： bean sprouts; liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; plant growth regulator; 4-chlorophenoxyacetate; 6-benzyl adenine

豆芽是餐桌上常見的美食，含有蛋白質(zhì)、維生素和粗纖維等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有補(bǔ)充人體所需氨基酸、降低膽固醇、促進(jìn)腸胃蠕動和消腫利尿等作用，深受人們喜愛[1-3]。近年來，不法商販為了縮短豆芽的生長周期和增加產(chǎn)量，在加工過程中使用了植物生長調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、生長以及豆芽下胚軸增粗，抑制軸長和根部萌發(fā)，以達(dá)到加粗豆芽頸部生長的目的[4-6]。人們食用后，能引起惡心、嘔吐等胃部不良反應(yīng)，損害人體皮膚、食道、胃黏膜等，給人們的身體健康造成巨大危害[7-9]。市場監(jiān)督管理局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布了《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》（2015年第11號），明確規(guī)定在豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)[10]，并將其列為食品監(jiān)管領(lǐng)域重點(diǎn)工作，在每年的國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中均有體現(xiàn)?；诙寡恐兄参锷L調(diào)節(jié)劑的測定（BJS 201703）方法[11]，采用QuEChERS離心管凈化樣品時，會損失部分樣品提取液，影響試驗(yàn)準(zhǔn)確度，因此本研究建立了LC-C18固相萃取柱凈化法，凈化提取液時抽干萃取柱，損失極少，且操作簡單快速，能夠準(zhǔn)確測定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與藥品

4-CPA和6-BAP為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）;甲醇、乙腈（歐普森（Oceanpak）色譜純）;甲酸、乙酸銨、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）;實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Quantum Ultra EMR System，美國賽默飛世爾科技公司;電子分析天平：AR224CN，±0.000 1 g，上海天平儀器廠;高速冷凍離心機(jī)：CF16RXⅡ，日本日立;全自動均質(zhì)器：AH-40，?？?渦旋混合器：Vortex I，IKA;氮吹儀：MTN-5800，天津奧特賽恩斯儀器有限公司;超純水系統(tǒng)：重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司的MOL PW500EDI;C18色譜柱：thermo，hypersil gold（C18） 100 mm×2.1 mm，1.9 μm;LC-C18固相萃取柱：CNW，6 mL/500 mg。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制。4-CPA標(biāo)準(zhǔn)溶液和6-BAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，含量均為100 μg/mL，準(zhǔn)確吸取1 mL 2種標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;準(zhǔn)確吸取10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，將其變成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）含1%甲酸的乙腈溶液配制。量取10 mL甲酸，加入乙腈稀釋至1 000 mL，混勻。

（3）含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液配制。稱取0.385 4 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1 000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)試樣10.0 g（精確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿提取2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水硫酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5 min使乙腈和水相分層。

（2）凈化。LC-C18固相萃取柱，使用前用水和甲醇各6 mL活化，精確量取上層乙腈溶液4 mL于LC-C18固相萃取柱中，氮吹管接收凈化液，并抽干萃取柱，于45 ℃氮?dú)獯蹈?，甲醇定容? mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取空白試樣10.0 g（準(zhǔn)確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，進(jìn)行前處理，作為空白基質(zhì)提取液。分別精確量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）0 μL、10 μL、20 μL和40 μL，及標(biāo)準(zhǔn)混合中間液（10 μg/mL）10 μL、15 μL和20 μL，用空白基質(zhì)提取液定容至1.0 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度依次為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，臨用時現(xiàn)配[11]。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：C18色譜柱柱溫：30 ℃，流動相：溶劑A（含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液），溶劑B（甲醇）;流速：0.25 mL/min;梯度洗脫條件：0～1 min 5%B，1～3 min 5%～95%B，3～7.1 min?95%B，7.1～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），氬氣為碰撞氣;毛細(xì)管溫度（℃）：350，鞘氣（Arb）：45，輔助氣（Arb）：10，噴霧電壓（V）：3 000，離子掃描模式：負(fù)離子掃描模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1 μg/mL的4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，在液相質(zhì)譜聯(lián)用儀ESI-模式下掃描，優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇信號強(qiáng)度理想的母離子和子離子作為定性定量離子，篩選結(jié)果見表1。取100 ng/mL的4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)驗(yàn)證目標(biāo)物出峰效果，4-CPA和6-BAP的總離子流圖結(jié)果見圖1，出峰時間分別為5.78 min和5.66 min，離子豐度比分別為34.1%和49.0%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線

4-CPA和6-BAP的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液均為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，上機(jī)檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果數(shù)據(jù)分析，出現(xiàn)3個母離子，分別是質(zhì)核比（m/z）為184.905的4-CPA、質(zhì)核比（m/z）為187.000的4-CPA和質(zhì)核比（m/z）為224.070的6-BAP，線性回歸方程分別為：Y=729.645+769.358X、Y=3 779.49+2 249.89X和Y=1 991.1+5 621.12X，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9、0.999 4和0.997 5，呈現(xiàn)線性良好，見圖2。

2.3 回收率和精密度

豆芽樣品中，加入4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇在10 μg/kg，20 μg/kg，100 μg/kg進(jìn)行3水平回收試驗(yàn)，每個水平6個平行，回收率和精密度結(jié)果如表2所示，平均回收率為84.3%～94.6%，RSD為2.6%～10.3%。

2.4 檢出限和定量限

空白基質(zhì)中加入4-CPA和6-BAP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行前處理，上機(jī)測定，扣除基線后，以信噪比S/N=3時對應(yīng)的含量為檢出限，信噪比S/N=10時對應(yīng)的含量為定量限，結(jié)果顯示4-CPA的檢出限和定量限分別為1.54 μg/kg和4.28 μg/kg，6-BAP的檢出限和定量限分別為0.237 μg/kg和0.459 μg/kg。

3 結(jié)論

本文對豆芽中4-CPA和6-BAP的液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測法的前處理過程、液相色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇甲醇活化后的LC-C18固相萃取柱凈化樣品，操作簡單、快速且準(zhǔn)確度高。質(zhì)譜條件優(yōu)化后，篩選出了4-CPA和6-BAP響應(yīng)強(qiáng)度較高的離子作為定量定性離子，其離子豐度比為分別為34.1%和49.0%，允許的相對偏差范圍為±25%[12]，可以有效提高檢測的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示該方法前處理簡單快速、線性良好，回收率和精密度高，可以準(zhǔn)確測定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，滿足國內(nèi)外豆芽中對4-CPA和6-BAP限量的檢測需求。

參考文獻(xiàn)

[1]馬雪豐.高效液相色譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉殘留量[J].南方農(nóng)業(yè)，2016，10（16）：27-30.

[2]葉佳明，王京，鐘世歡，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2018（4）：39-42.

[3]胡祥娜，顧亞萍，林慧純，等.高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法同時測定豆芽中7種藥物殘留[J].食品科學(xué)，2014，35（20）：253-257.

[4]楊婕，黃少文，孫遠(yuǎn)明，等.4-氯苯氧乙酸鈉對豆芽生長的影響及其殘留分析[J].食品工業(yè)科技，2015，36（15）：104-108.

[5]李娜，盧娜，邵輝，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，26（4）：1-5.

[6]張亞蓮，柳菡，王歲樓，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中8種藥物殘留[J].分析測試學(xué)報，2015，34（2）：164-170.

[7]柳菡，吳斌，殷耀，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定芽苗類蔬菜及其來源豆類中4種非法添加物的殘留量[J].色譜，2013，31（1）：22-26.

[8]趙浩軍，楊吉玉，陳朋云，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豆芽中6-芐基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（14）：4732-4736.

[9]張婧雯，郭春海，葛世輝，等.固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、赤霉素和4-氯苯氧乙酸的殘留量[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2014，26（5）：441-445.

[10]佚名.國家食品藥品監(jiān)督管理總局 農(nóng)業(yè)部 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2015，27（3）：276.

[11]佚名.總局關(guān)于發(fā)布食品中西布曲明等化合物的測定等3項(xiàng)食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的公告[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2017，29（2）：217.

[12]上海市食品藥品檢驗(yàn)所.BJS 201703 豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定[EB/OL].（2017-07-07）[2021-10-09].https：//www.doc88.com/p-3035672754514.html.