反相高效液相色譜法測(cè)定常見(jiàn)食品中乳酸、富馬酸的含量

陳振中

（中科檢測(cè)技術(shù)服務(wù)（廣州）股份有限公司，廣東廣州 510000）

摘 要：為測(cè)定常見(jiàn)食品中乳酸、富馬酸的含量，建立了常見(jiàn)食品中乳酸、富馬酸提取及反相高效液相色譜的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)選用葡萄酒、含乳飲料、糕點(diǎn)為基質(zhì)，添加乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品混勻，用水浸泡超聲提取、稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45μm 無(wú)機(jī)濾膜后，以高效液相色譜反相C18柱分離，通過(guò)PDA二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，以上3種基質(zhì)用該測(cè)定方法檢測(cè)的平均回收率分別為乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富馬酸96.3%、95.5%、97.9%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富馬酸1.2%、1.0%、0.3%。

關(guān)鍵詞：常見(jiàn)食品;乳酸;富馬酸;反向高效液相色譜法;PDA二極管陣列檢測(cè)器

Determination of Lactic Acid and Fumaric Acid in Several Common Foods by High-performance Liquid Chromatography

CHEN Zhenzhong

（CAS Testing Technical Services （Guangzhou） CO.， Ltd.， Guangzhou 510000， China）

Abstract： In order to determine the content of lactic acid and fumaric acid in common foods， methods for the determination of lactic acid and fumaric acid extraction and reversed-phase high performance liquid chromatography in common foods were established. In this experiment， wine， milk-containing beverages， and pastries were used as the substrate， and lactic acid and fumaric acid standards were added and mixed， soaked in water and ultrasonically extracted， diluted to the mark， shaken， centrifuged at 5 000 r/min for 10 minutes， and the supernatant was passed through a 0.45μm? inorganic filter membrane. It was then used as a sample solution， and then separated by a reversed-phase C18 column of high performance liquid chromatography， and detected by a PDA diode array detector. The test results show that the average recoveries of the above 3 substrates detected by this method are lactic acid 97.7%， 95.5%， 99.1%， fumaric acid 96.3%， 95.5%， 97.9%; the relative standard deviations are lactic acid 1.1%， 1.5%， 4.4%， fumaric acid 1.2%， 1.0%， 0.3%.

Keywords： common foods; lactic acid; fumaric acid; high-performance liquid chromatography; PDA diode array detector

富馬酸即名延胡索酸，富馬酸可作為酸度調(diào)節(jié)劑、酸化劑、抗氧化助劑、腌制促進(jìn)劑和香料使用。本品有強(qiáng)緩沖作用，保持水溶液pH在3.0左右，并對(duì)抑菌防霉有重要作用，同時(shí)有澀味，是酸味極強(qiáng)的固體酸之一，吸收率低，有助于延長(zhǎng)粉末制品等的保存期。當(dāng)富馬酸變?yōu)楦获R酸鈉后，水溶性及風(fēng)味均更好。乳酸有很強(qiáng)的防腐保鮮功效，可用在果酒、飲料、糕點(diǎn)等食品中具有調(diào)節(jié)pH值、抑菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期、調(diào)味、保持食品色澤和提高產(chǎn)品質(zhì)量等作用，食品中加入一定量的乳酸，可保持產(chǎn)品中的微生物的穩(wěn)定性、安全性，同時(shí)使口味更加溫和[1]。

現(xiàn)行有效的高效液相色譜法檢測(cè)食品中的富馬酸、乳酸的方法一般局限在飼料、果汁、農(nóng)產(chǎn)品等，鮮有運(yùn)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中的富馬酸、乳酸的方法。本實(shí)驗(yàn)建立了常見(jiàn)食品中乳酸、富馬酸提取及反相高效液相色譜的測(cè)定方法，選用含乳飲料、葡萄酒、糕點(diǎn)為基質(zhì)，添加乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品混勻，用水浸泡、稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm無(wú)機(jī)濾膜后作為樣液，然后以高效液相色譜反相C18柱分離，通過(guò)PDA二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試含乳飲料（原味椰子果粒酸奶飲品，廣州市貝奇飲料有限公司生產(chǎn)）;供試葡萄酒（菲芃莊園葡萄酒，廣州市圣羅倫酒業(yè)有限公司生產(chǎn)）;供試糕點(diǎn)（核桃包，廣州包多寶食品有限公司生產(chǎn)）;乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量89.9%，英國(guó)LGC公司）;富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量99.2%，英國(guó)LGC公司）;磷酸二氫銨（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）;超純水（電阻率為

18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance e2695高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）;2998 PDA Detector光電二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）;Uranus C18色譜柱（4.6 mm×

250 mm×5 μm，廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司），電子分析天平（GH-252，廣州市艾安得儀器有限公司）;超聲波清洗機(jī)（GT-2013QTS，廣東固特超聲股份有限公司）;低速離心機(jī)（KA-1000，上海安亭科學(xué)儀器廠）;Cascada I 超純水儀（美國(guó)PALL公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

秤取乳酸標(biāo)準(zhǔn)品55.6 mg、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品50.4 mg，分別加水轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中，定容至刻度，配置成濃度均為1.0 mg/mL的乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別吸取適量乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于50.0 mL容量瓶中，配制成6個(gè)不同濃度混標(biāo)（包括空白試樣）。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍：0 μg/mL、8.33 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL;富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍：0 μg/mL、0.083 3 μg/mL、0.250 0 μg/mL、5.000 0 μg/mL、10.000 0 μg/mL、25.000 0 μg/mL。

乳酸、富馬酸在上述濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。線性回歸方程分別為：乳酸Y=16.733x-11.673、富馬酸Y=8.180x-5.590。相關(guān)系數(shù)分別為：乳酸R=0.999 97、富馬酸R=0.999 981.3.2 高效液相色譜條件色譜柱：Uranus C18色譜柱4.6 mm×250 mm×5 μm;流動(dòng)相：1 mol/L磷酸二氫銨溶液，磷酸調(diào)節(jié)pH=2.5;流速：0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.3 樣品前處理

取有代表性樣品500 g混合均勻，裝入潔凈容器內(nèi)密閉并標(biāo)明標(biāo)記，于4 ℃保存。秤取樣品約5 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，25 mL超純水水浸泡1 h，超聲提取1 h，稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm無(wú)機(jī)濾膜后作為樣液，供HPLC測(cè)定。

1.3.4 流動(dòng)相pH值相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

配制1 mol/L磷酸二氫銨溶液并用磷酸調(diào)節(jié)pH值，分別配制成pH=2.0、pH=2.5、pH=3.0的1 mol/L磷酸二氫銨溶液，分別以此作為流動(dòng)相上機(jī)檢測(cè)，其他色譜條件不變。收集乳酸、富馬酸標(biāo)樣保留時(shí)間、峰寬、分離度，分析兩者與流動(dòng)相pH值的相關(guān)性，選擇最優(yōu)流動(dòng)相pH值進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 方法檢出限實(shí)驗(yàn)

選用信噪比法確定方法檢出限。分別稱取500.0 g?3種基質(zhì)樣品各3份，并分別添加乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg、0.10 mg;50.0 mg、0.50 mg;100.0 mg、1.00 mg，每種基質(zhì)樣品中乳酸、富馬酸樣品濃度水平分別為20.0 mg/kg、0.20 mg/kg;100.0 mg/kg、1.00 mg/kg;200.0 mg/kg、2.00 mg/kg。稱取適量樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，確定本實(shí)驗(yàn)室對(duì)本方法的檢出限。

1.3.6 方法回收率與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取葡萄酒、含乳飲料、糕點(diǎn)3種基質(zhì)樣品500.0 g各兩份，樣品中分別添加乳酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)125.0 mg，1.25 mg樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg。按照本文樣品前處理方法提取及凈化處理樣品得到1.0 mL樣液 ，用高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相pH值相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知，當(dāng)流動(dòng)相pH=2.5、pH=3.0時(shí)，分離度（R）分別為3.183、7.821，均>2，有較好分離度。當(dāng)流動(dòng)相pH=2.5時(shí)，所有待測(cè)物完全出峰所需時(shí)間適中，且分離度（R）>2，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相pH均選擇pH=2.5。標(biāo)準(zhǔn)樣中目標(biāo)物的色譜圖見(jiàn)圖1;葡萄酒、含乳飲料、糕點(diǎn)3種基質(zhì)中目標(biāo)物色譜圖分別見(jiàn)圖2～4。

2.2 方法檢出限

本文主要選用信噪比法進(jìn)行研究。峰高及基線最大波動(dòng)值數(shù)據(jù)如表2。由表2可知，乳酸濃度水平為100.0 mg/kg、富馬酸度水平為0.020 mg/kg時(shí)，信噪比明顯，分別為5倍、2倍，所以本實(shí)驗(yàn)以乳酸濃度水平100.0 mg/kg、富馬酸度水平0.020 mg/kg為方法檢出限，與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《進(jìn)出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測(cè)方法 高效液相色譜法》（SN/T 2007—2007）方法檢出限相近，符合要求。

2.3 方法回收率與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用高效液相色譜分析，每種基質(zhì)樣品重復(fù)測(cè)定6次，進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果計(jì)算X=。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。本次實(shí)驗(yàn)樣品基質(zhì)空白為0，樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg，葡萄酒、含乳飲料、糕點(diǎn)3種樣品基質(zhì)平均添加回收率分別為乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富馬酸96.3%、95.5%、97.9%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富馬酸1.2%、1.0%、0.3%，結(jié)果表明該方法精密度、重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本方法具有較低的檢出限，較好的靈敏度與重現(xiàn)性，能夠簡(jiǎn)單、快速、靈敏地對(duì)常見(jiàn)食品基質(zhì)中的乳酸、富馬酸實(shí)現(xiàn)較好地分離、定性與定量，適用于常見(jiàn)食品基質(zhì)中乳酸、富馬酸含量的測(cè)定，適用于常見(jiàn)食品基質(zhì)中乳酸、富馬酸含量檢測(cè)。

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