蒼耳子散對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠炎癥及AQP5蛋白表達(dá)的影響

沈明 黃小強(qiáng)

【摘 要】 目的：研究蒼耳子散對(duì)變應(yīng)性鼻炎（AR）小鼠鼻腔炎癥及水通道蛋白5（AQP5）表達(dá)的影響。方法：將60只小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、氯雷他定組、蒼耳散低劑量組、蒼耳散中劑量組和蒼耳散高劑量組，每組10只，除正常組外，其他各組小鼠制備AR模型，氯雷他定組灌胃氯雷他定藥液，蒼耳子散低、中、高劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量蒼耳子散藥液，連續(xù)給藥14d，每天一次。觀察各組小鼠體質(zhì)量、撓鼻次數(shù)、打噴嚏次數(shù)、臟器指數(shù)、采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IgE、IL-5、IL-4、IFN-γ、HIS和IL-10含量，利用Western Blot法檢測(cè)鼻黏膜組織匯總AQP5蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組相比，模型組小鼠終末體質(zhì)量、IFN-γ、IFN-γ/IL-4和AQP5蛋白表達(dá)水平顯著性降低（P<0.05，P<0.01），小鼠撓鼻次數(shù)，打噴嚏次數(shù)，臟器指數(shù)，IgE、IL-5、IL-4、HIS和IL-10含量均顯著性增加（P<0.05，P<0.01）。與模型組相比，蒼耳子散中劑量組小鼠撓鼻次數(shù)，打噴嚏次數(shù)，脾臟指數(shù)，血清中IL-4、IgE、HIS、IL-5和IL-10含量顯著性降低（P<0.05，P<0.01），蒼耳子散高劑量組小鼠撓鼻次數(shù)，打噴嚏次數(shù)，脾臟指數(shù)，血清中IL-4、IgE、HIS、IL-5和IL-10含量顯著性降低（P<0.05，P<0.01），而小鼠終末體質(zhì)量，IFN-γ、IFN-γ/IL-4和AQP5蛋白表達(dá)水平顯著性增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：蒼耳子散可顯著緩解AR小鼠臨床癥狀，降低血清炎性因子含量，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及AQP5蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 蒼耳子散;變應(yīng)性鼻炎;炎性因子;AQP5;小鼠

【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）21-0019-06

Effects of Xanthium Powder on Inflammation and AQP5 Protein Expression in Allergic Rhinitis Mice

SHEN Ming1 HUANG Xiaoqiang2*

1.The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China;2.MedicalSchool，Huanghe Science & Technology College，Zhengzhou 450063，China

Abstract：Objective To study the effect of Xanthium powder on nasal inflammation and AQP5 expression in allergic rhinitis （AR） mice.Methods 60 mice were randomly divided into normal group， model group， loratadine group， Xanthium powder low-dose group， Xanthium powder medium dose group and Xanthium powder high-dose group， 10 in each group， In addition to the normal group， other groups of mice made AR model， the loratadine group was given loratadine solution by gavage， while the low， medium， and high-dose Xanthium powder groups were intragastrically administered with corresponding doses of Xanthium powder， once a day for 14 consecutive days. The body weight， nasal scratching times， sneezing times， organ index， IgE， IL-5， IL-4， IFN-γ， HIS and IL-10 in serum were detected by ELISA， and AQP5 protein expression in nasal mucosa was detected by Western blot.Result Compared with the normal group， the weight of terminal body， the expression of IFN-γ， IFN-γ/IL-4 and AQP5 protein in the model group were significantly decreased （P<0.05，P<0.01）， and the number of nose scratching， sneezing frequency， organ index， IgE， IL-5， IL-4， HIS and IL-10 were significantly increased （P<0.05，P<0.01）. Compared with the model group， the number of scratching nose， sneezing frequency， spleen index， contents of IL-4， IgE， HIS， IL-5 and IL-10 in serum were significantly decreased in the middle dose group （P<0.05，P<0.01）， while the nasal scratching times， sneezing times， spleen index， IL-4， IgE， HIS， IL-5 and IL-10 contents in serum were significantly decreased in the high-dose Xanthium powder group （P<0.05，P<0.01）， However， the weight of mouse terminal body， the expression of IFN-γ，IFN-γ/IL-4 and AQP5 protein were significantly increased （P<0.05，P<0.01）.Conclusion Cangerzi powder can significantly alleviate the clinical symptoms of AR mice and reduce the content of serum inflammatory factors， which may be related to the expression of AQP5 protein.

Keywords：Xanthium Powder; Allergic Rhinitis; Inflammatory Factor; AQP5; Mice

變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR），即過敏性鼻炎，是指特異性個(gè)體接觸變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎性疾病，主要臨床表現(xiàn)為鼻塞、鼻涕、噴嚏和鼻癢，是臨床最為常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病之一[1-2]。近幾十年來，隨著環(huán)境污染，飲食習(xí)慣、營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和體質(zhì)變化等因素的影響，AR的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)前已影響全球10%～25%的人群[3]，被視為“21世紀(jì)的流行病”。AR屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”的范疇，中醫(yī)藥治療本病多采用辨證論治，辨證以虛寒為主，治法以溫補(bǔ)居多，療效尚不滿意[4]。因此，尋找有效防治變應(yīng)性鼻炎的中醫(yī)藥是重要的課題之一。

蒼耳子散源記載自宋代的《濟(jì)生方》中：“辛夷仁半兩，蒼耳子兩錢半，香白芷一兩，薄荷葉半錢，上曬干，為細(xì)末，每服兩錢，食后用蔥、茶清調(diào)下?！狈街猩n耳子味甘入肺，具有發(fā)汗通竅，散風(fēng)祛濕之功，同時(shí)能使清陽之氣上升;辛夷味辛入肺胃經(jīng)，具有通肺竅、散風(fēng)寒之功;薄荷辛散祛風(fēng)，白芷辛溫通竅，諸藥共奏疏風(fēng)止痛、利鼻通竅之功。歷代醫(yī)家青睞蒼耳子散治療鼻淵、鼻鼽等疾患，每每奏驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，探討蒼耳子散對(duì)其治療作用及其可能存在的機(jī)制，為蒼耳子散對(duì)變應(yīng)性鼻炎的治療作用提供藥理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)KM雄性小鼠60只，體重（20±2）g，6周齡，購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）：2017-0005，動(dòng)物合格證編號(hào)：20170005006012。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后實(shí)驗(yàn)，小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫維持22～26 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，晝夜循環(huán)，保持12 h光照。

1.2 試藥與儀器

1.2.1 藥物 氯雷他定片（上海先靈葆雅制藥公司）;蒼耳子散（蒼耳子6 g、辛夷9 g、白芷9 g和薄荷1 g，每劑）;給藥前，將1劑蒼耳子散加入30 mL蒸餾水煎煮至2 g/mL的母液，備用。

1.2.2 試劑 OVA（Sigma公司）;AL（OH）3（國藥集團(tuán)）;IgE、IL-5、IL-4、IFN-γ、HIS和IL-10ELISA檢測(cè)試劑盒（上海西唐科技有限公司）;AQP5抗體（SantaCruz公司公司）;β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）;二抗羊抗鼠和羊抗兔。

1.2.3儀器 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Infinite公司），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司），DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司），垂直電泳槽、多功能成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 AR造模[5-6] 將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分成正常組、模型組、氯雷他定組、蒼耳子散低劑量組、蒼耳子散中劑量組、蒼耳子散高劑量組，每組10只。除正常組外，其他各組均于第0、7、14天腹腔注射300 μL含25 μg OVA、1 mg氫氧化鋁的PBS基礎(chǔ)致敏，正常組腹腔注射等體積的PBS。從第21天開始用注射器取濃度為25 mg/mL的 OVA溶液滴鼻局部刺激，每側(cè)滴注20 μL進(jìn)行激發(fā)，正常組滴注等體積的PBS。共計(jì)滴注7d，在第30天摘眼球取血后，脫頸椎處死小鼠，取材。

1.4 給藥 在造模第14天開始灌胃給藥，依據(jù)人與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量換算公式，氯雷他定組給予20 mg/kg的氯雷他定藥液（氯雷他定加入0.9%氯化鈉注射液配制為1g/mL藥液）。蒼耳子散低、中、高劑量組分別灌胃3、6、12 g/kg的蒼耳子散藥液，模型組和正常組小鼠灌胃等劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 蒼耳子散對(duì)AR小鼠行為學(xué)指標(biāo)的觀察[7] 各組均于末次給藥后立即對(duì)小鼠撓鼻、打噴嚏行為進(jìn)行觀察，累計(jì)10 min，并記錄各組小鼠撓鼻和打噴嚏次數(shù)。

1.5.2 蒼耳子散對(duì)AR小鼠臟器指數(shù)的影響 小鼠處死后，取其脾臟、胸腺，稱重后計(jì)算其脾臟、胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）

胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/小鼠體重（g）

1.5.3 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 小鼠取血后，3000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，取上清，采用ELISA法檢查血清IL-10、HIS、IL-5、IgE、IFN-γ及IL-4含量，具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 AQP5蛋白檢測(cè) 取小鼠鼻腔粘膜組織，采用液氮研磨法，以1∶10比例（0.1 g組織：1 mL裂解液），12000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，制備樣品，采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗，其中內(nèi)參1∶5000，其他抗體1∶1000，過夜，TBST沖洗3次，加入二抗1∶5000，TBST沖洗3次，ECL發(fā)光液顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 蒼耳子散對(duì)AR小鼠行為學(xué)的影響 打噴嚏、撓鼻、流鼻涕是AR患者的三大癥狀，打噴嚏、撓鼻的次數(shù)可以反應(yīng)AR的嚴(yán)重程度。與正常組相比，模型組小鼠撓鼻次數(shù)和打噴嚏次數(shù)明顯增加（P<0.01），表明OVA能夠顯著性升高小鼠撓鼻次數(shù)和打噴嚏次數(shù)。與模型組相比，蒼耳子散各劑量組均能夠減少小鼠撓鼻次數(shù)和打噴嚏次數(shù)，其中中劑量和高劑量具有顯著性（P<0.05，P<0.01）。因此，根據(jù)小鼠撓鼻次數(shù)和打噴嚏次數(shù)情況，蒼耳子散能夠緩解AR小鼠鼻炎的癥狀。見表1。

2.2 蒼耳子散對(duì)AR小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響 各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)初始階段，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）;終末體質(zhì)量，與正常組相比，模型組小時(shí)體質(zhì)量顯著性降低（P<0.01）;與模型組相比，蒼耳子散各劑量組小鼠體質(zhì)量均增加，其中高劑量組體質(zhì)量增加具有顯著性（P<0.05）。見表2。

與正常組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯升高（P<0.01），提示，OVA能夠顯著性升高小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù);與模型組相比，蒼耳子散組各劑量均能夠不同程度降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其中中劑量組能夠顯著性降低脾臟指數(shù)，中劑量和高劑量組能夠顯著性降低胸腺指數(shù)（P<0.05，P<0.01）。見表3。

2.3 蒼耳子散對(duì)AR小鼠血清中IL-4、IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-4含量顯著性升高，而IFN-γ含量卻顯著性降低，其IFN-γ/IL-4也顯著性降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，蒼耳子散各劑量組能夠不同程度降低IL-4含量，其中中劑量和高劑量組顯著性降低（P<0.05，P<0.01），蒼耳子散各劑量組能夠不同程度升高IFN-γ含量和IFN-γ/IL-4比值，其中高劑量組中IFN-γ含量及中劑量組和高劑量組中IFN-γ/IL-4比值顯著性降低（P<0.05，P<0.01）。詳見表4。

2.4 蒼耳子散對(duì)AR小鼠血清中IgE和HIS含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中IgE和HIS含量均顯著性升高（P<0.01）;與模型組相比，蒼耳子散各劑量組均能夠不同程度降低IgE和HIS含量，其中中劑量和高劑量組均能夠顯著性降低IgE和HIS含量（P<0.05，P<0.01）。見表5。

2.5 蒼耳子散對(duì)AR小鼠血清中IL-5和IL-10含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-5和IL-10含量均顯著性升高（P<0.01）;與模型組相比，蒼耳子散各劑量組均能夠不同程度降低IL-5和IL-10含量，其中中劑量和高劑量組均能夠顯著性降低IL-5和IL-10含量（P<0.05，P<0.01）。見表6。

2.6 蒼耳子散對(duì)AR小鼠鼻黏膜組織中AQP5蛋白表達(dá)的水平影響 與正常組相比，模型組小鼠鼻黏膜組織中AQP5蛋白表達(dá)水平顯著性降低（P<0.01）;與模型組相比，蒼耳子散各劑量組均能夠不同程度降低AQP5蛋白表達(dá)水平，其中高劑量組能夠顯著性降低AQP5蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01）。如圖1所示。

3 討論

AR為臨床多發(fā)病，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響，使患者工作與學(xué)習(xí)效率下降[8-9]。過敏性鼻炎是鼻黏膜接觸過敏原后由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，以鼻癢、打噴嚏、鼻黏膜腫脹及鼻分泌亢進(jìn)等為主要臨床癥狀。近年來，由于受空氣污染等因素的影響，過敏性鼻炎發(fā)病率逐年升高，是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疾病[10-11]。

臨床常用的抗變應(yīng)性鼻炎的藥物主要有抗組胺藥、過敏反應(yīng)介質(zhì)阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑和免疫調(diào)節(jié)劑等[12]。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)觀察AR動(dòng)物的噴嚏次數(shù)和撓鼻次數(shù)能夠較為直觀的反應(yīng)藥物對(duì)AR的治療作用。結(jié)果表明，蒼耳子散灌胃后，能夠明顯減少AR小鼠的噴嚏次數(shù)和撓鼻次數(shù)。

變應(yīng)原進(jìn)入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的IgE抗體，并通過Fc段與具有相應(yīng)IgEFcεR的MC或嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合，促使免疫細(xì)胞脫顆粒，以及釋放生物活性物，例如組胺、激肽原酶等[13]，從而引起過敏性鼻炎。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒼耳子散能夠顯著性降低AR小鼠血清中HIS和IgE的含量，提示蒼耳子散可通過抑制HIS和IgE的分泌緩解變應(yīng)性鼻炎癥狀的目的。

在變應(yīng)性鼻炎反應(yīng)中，Th0細(xì)胞分化成Th1和Th2細(xì)胞，并產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，Th2細(xì)胞則大量分泌IL-4、IL-5、IL-13和IL-10等細(xì)胞因子[14]。IFN-γ可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞在氣道的浸潤(rùn)，在變應(yīng)性鼻炎反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用[15]。IL-4是Th2細(xì)胞的特征細(xì)胞因子。IL-10是由單核細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子，少部分由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。IL-5在EOS的分化、成熟、黏附、浸潤(rùn)和凋亡過程中發(fā)揮極其重要的作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子散能夠降低AR小鼠血清中的IL-4、IL-5和IL-10的含量，同時(shí)上調(diào)INF-γ的含量及INF-γ/IL-4比值。提示蒼耳子散可通過調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞因子的分泌來調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，從而抑制AR小鼠的炎癥反應(yīng)。

水通道蛋白（Aquapcriins，AQPs）是一組與水液轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它在體內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)和大多數(shù)腺體分泌方面具有重要作用。目前在鼻腔黏膜中發(fā)現(xiàn)有AQP1、AQP3、AQP4和AQP5，而AQP5在鼻黏膜中的分布和表達(dá)異常是導(dǎo)致水液輸布和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是維持AR高分泌狀態(tài)的原因之一[17]。研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子散能夠增加AR小鼠鼻腔組織中AQP5蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，蒼耳子散對(duì)變應(yīng)性鼻炎的具有治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及AQP5蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-03-10 編輯：劉斌）