基于肝細(xì)胞癌可控納米遞藥系統(tǒng)的應(yīng)用研究〔1〕

王艷琴

(江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江西 南昌 330003)

據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，肝癌是我國(guó)第二位的惡性腫瘤，每年的死亡人數(shù)超過10萬，占世界肝癌死亡人數(shù)的40%左右。因此，對(duì)于肝癌的靶向性遞藥研究顯得尤為重要。藥物遞釋系統(tǒng)到達(dá)腫瘤部位后，仍然面臨如何滲透入腫瘤內(nèi)部、如何提高藥物在腫瘤核心區(qū)域分布的問題。因此，構(gòu)建能夠靶向肝癌細(xì)胞，且具有高腫瘤穿透能力的靶向遞藥系統(tǒng)具有十分重要的意義。研究表明[2-3]，不同粒徑的納米粒對(duì)實(shí)體瘤的穿透能力和滯留能力有顯著區(qū)別。小粒徑(如粒徑20 nm)納米粒的穿透能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大粒徑納米粒(如粒徑200 nm)，然而小粒徑納米粒在腫瘤部位的滯留能力卻遜于大粒徑納米粒。為克服這一缺陷，本研究構(gòu)建了可收縮納米?！揎椝难趸F納米粒的凝膠納米粒(Gel)。該納米粒粒徑為150 nm左右，在腫瘤部位具有較好的滯留能力。滯留于腫瘤后由于腫瘤部位酶的作用，使凝膠降解而釋放出僅有10 nm的四氧化三鐵納米粒，從而有望具有更好的滲透性[4-6]。然而該策略僅有體外研究，尚無用于腫瘤靶向治療的研究報(bào)道。本文擬采用此策略構(gòu)建具有腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性的可收縮肝癌靶向遞藥系統(tǒng)，以期在具有良好腫瘤靶向性的同時(shí)，進(jìn)一步提高遞藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤的穿透性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ZNCL-T1000集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(西安予輝儀器有限公司)，DZF6050真空干燥箱(溫州鼎力醫(yī)療器械有限公司)，lx73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 主要材料

Gel、樹枝狀高分子聚合物聚左旋賴氨酸(DGL)和紫杉醇(PTX)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和熒光探針香豆素-6(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自北京索來寶有限公司)；DAPI(購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司)。

1.3 載體材料的合成

精密稱取凝膠納米粒-探酰氯(Gel-COCl)100 mg和DGL-a-Co(OH) 1.5 g于250 mL燒瓶中，甲苯-四氫呋喃(3∶1)20 mL作為反應(yīng)溶劑，三乙胺2 mL作為催化劑，在80 ℃條件下連續(xù)回流48 h(氮?dú)獗Ｗo(hù))，得到的反應(yīng)溶液趁熱減壓濾過并用四氫呋喃和蒸餾水反復(fù)清洗，得到的黑色固體置于60 ℃干燥箱中干燥24 h，至產(chǎn)物得到恒定質(zhì)量，產(chǎn)量約為55.44%。紫外可見吸收光滑法測(cè)試合成表征藥物載體材料的發(fā)光性能。

1.4 載PTX復(fù)合物的制備

精密稱取DGL-Gel 4 mg，加入PTX無水乙醇溶液0.5 mL，邊超聲邊滴加超純水3 mL，探頭超聲(功率400 W，工作3 s，間隔6 s，超聲10次)，4 000 r/min離心15 min，棄上清，取沉淀，加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的泊洛沙姆188溶液5 mL，在探頭超聲條件下再經(jīng)4 000 r/min離心15 min，取上清，冷凍干燥得到PTX-DGL-Gel。采用色譜分析技術(shù)證實(shí)DGL-Gel對(duì)PTX的測(cè)定無干擾。

1.5 體外溶血試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照管上層液體為無色透明，無溶血發(fā)生；陽(yáng)性對(duì)照管呈澄明紅色則發(fā)生了全溶血。PTX-DGL-Gel質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，溶血率為4.9%，溶血率隨著質(zhì)量濃度的上升而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，溶血率為68.7%。

1.6 生物相容性評(píng)價(jià)

將hepG2細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入終質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25 mg/mL的PTX-DGL和PTX-DGL-Gel材料各200 μL，對(duì)照組加入等體積含血清培養(yǎng)基，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光加入10 μg/mL的MTT 150 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

調(diào)整hepG2細(xì)胞1×104/mL加入96孔培養(yǎng)板，分別加入PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.050，0.100和0.500 μg/mL，同樣MTT方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.8 細(xì)胞攝取試驗(yàn)

首先，構(gòu)建Zn(z)-Cys(6)(簡(jiǎn)稱C6)標(biāo)記載體，制備C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel材料，熒光分光光度法測(cè)定C6載藥量為21.46%。然后將hepG2細(xì)胞1×104/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液漂洗，加入2 mL無血清培養(yǎng)液稀釋的游離C6溶液、C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel，使香豆素的終質(zhì)量濃度為50 ng/mL；繼續(xù)孵育4 h，吸棄含藥培養(yǎng)液，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 次，4%多聚甲醛37 ℃固定20 min，DAPI染色15 min，冷PBS洗3次，防熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 生物相容性分析

hepG2細(xì)胞對(duì)PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有較好的生物相容性，細(xì)胞存活率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸下降，同濃度下，PTX-DGL-Gel對(duì)細(xì)胞的存活率顯著高于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

隨著PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞抑制率也逐漸升高，同濃度比較，PTX-DGL-Gel對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯大于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.3 細(xì)胞攝取率

培養(yǎng)48 h可見hepG2細(xì)胞對(duì)PTX-DGL-Gel的攝取率顯著高于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

3 討 論

癌癥是人類的第一殺手，目前對(duì)癌癥最常用的內(nèi)科治療方法仍以化療為主，化學(xué)藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)正常的組織細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒副作用，直接影響了患者的生理功能[7]。靶向給藥系統(tǒng)可以使藥物選擇性地濃集于病變器官、組織或者細(xì)胞中，提高化療藥物的治療效果，降低化療的系統(tǒng)毒性，是抗癌藥物新型制劑研究的方向[8]。目前用于靶向肝癌的用藥途徑主要有：第一，被動(dòng)靶向[9-10]。利用癌癥的病理和生理特點(diǎn)，透過肝組織中的Kupffer細(xì)胞攝取遞藥微粒而達(dá)到被動(dòng)靶向的作用。第二，主動(dòng)靶向。利用肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的受體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[11]、低密度脂蛋白受體[12]等，通過與之相對(duì)應(yīng)的配體修飾遞藥系統(tǒng)，利用配體受體之間的親和力，達(dá)到主動(dòng)靶向的作用。此外，樹枝狀高分子聚合物DGL具有易于修飾、載藥能力高、生物可降解等優(yōu)點(diǎn)[13]。DGL表面富含氨基，能夠方便用于修飾藥物和靶向分子，且其粒徑僅有5 nm，有望具有良好的穿透性[14]。因此本研究擬采用DGL作為載體。PTX是臨床一線抗腫瘤藥物，但其有毒副作用大、腫瘤靶向性差的缺點(diǎn)[15]，因此本研究選擇PTX作為模型藥物，將其修飾于DGL表面，形成藥物載體PTX-DGL。將藥物載體用明膠納米粒包裹而形成較大粒徑(約200 nm)的納米粒PTX-DGL-Gel，從而賦予該載體系統(tǒng)良好的腫瘤滯留能力和具有腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性的穿透能力[16]?？股锼氐鞍?Avidin)相對(duì)分子質(zhì)量約為66 KDa，為高度糖基化的蛋白，含有很多堿性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸，在通常情況下帶正電荷，Avidin的N端含乙酰半乳糖氨和甘露糖殘基，可以選擇性地聚集于肝臟部位[17]，還可以靶向肝癌細(xì)胞[18]。研究表明[19]，腹腔注射Avidin，可以選擇性地濃集于肝臟組織。本研究中，選擇Avidin作為靶向頭基修飾遞藥系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)肝癌的靶向給藥。該研究采用化學(xué)偶聯(lián)法合成PTX-DGL和PTX-DGL-Gel，紫外可見吸收光譜法對(duì)合成載體材料進(jìn)行表征。色譜分析技術(shù)證實(shí)，DGL-Gel對(duì)PTX的測(cè)定無干擾。體外溶血試驗(yàn)說明，在質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25 mg/mL時(shí)，hepG2細(xì)胞對(duì)PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有較好的生物相容性，隨著PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞抑制率逐漸升高，同濃度比較，PTX-DGL-Gel對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯大于PTX-DGL(P<0.05)。提示，PTX-DGL-Gel對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用明顯提高。培養(yǎng)48 h可見hepG2細(xì)胞對(duì)PTX-DGL-Gel的攝取率顯著高于PTX-DGL(P<0.05)。提示，細(xì)胞對(duì)PTX-DGL-Gel的靶向攝取效率明顯提高，體現(xiàn)了可控納米遞藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的主要特性[20]。

圖3 熒光標(biāo)記細(xì)胞藥物的攝取率

綜上所述，可控納米遞藥系統(tǒng)PTX-DGL-Gel與肝癌細(xì)胞hepG2有較好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞抑制率和攝取率明顯提高，增強(qiáng)了藥物的靶向療效。本研究根據(jù)肝癌的生理特點(diǎn)，利用腫瘤部位微環(huán)境，設(shè)計(jì)了能夠同時(shí)選擇性靶向肝癌細(xì)胞且具有良好腫瘤穿透性的可收縮納米遞藥系統(tǒng)PTX-DGL-Gel。該策略為肝癌的靶向診斷和治療提供了新思路，有望進(jìn)一步提高對(duì)肝癌的治療效果，具有重要的研究?jī)r(jià)值和潛在的應(yīng)用意義。