長萼堇菜葉蛋白水解物的制備及其活性分析

習(xí)雪玲，楊茗婷，覃婷，廖斌，張軍*

長萼堇菜葉蛋白水解物的制備及其活性分析

習(xí)雪玲1,2，楊茗婷1,2，覃婷1,2，廖斌3，張軍1,2*

(1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省生物技術(shù)候選藥物重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

以長萼堇菜(Blume)為材料，優(yōu)選堿提酸沉法參數(shù)，提取其葉蛋白；采用酶法制備葉蛋白水解物；利用超濾法分離葉蛋白水解物組分，分析葉蛋白水解物的抗氧化活性，并對葉蛋白水解物組分進(jìn)行固相萃取脫鹽、HPLC分析及其對腫瘤細(xì)胞的抑制活性和對線蟲壽命影響的測試。結(jié)果表明：采用料液比、堿提pH和酸沉pH分別為1∶9、10.0和4.5的參數(shù)組合可穩(wěn)定提取長萼堇菜葉蛋白；優(yōu)選的3種蛋白酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)均能有效將水解物主要酶解為相對分子質(zhì)量小于3.3×103的組分，并通過超濾可有效分離出相對分子質(zhì)量分別為<1×103(PH1)、1×103~<3×103(PH2)和≥3×103(PH3)的3個組分；長萼堇菜蛋白水解物中PH1組分的抗氧化活性和抑腫瘤細(xì)胞活性優(yōu)于其他組分；PH1和PH2延長線蟲壽命的效果相近，都優(yōu)于PH3。可見，長萼堇菜葉蛋白水解物組分PH1更具應(yīng)用開發(fā)價值。

長萼堇菜；葉蛋白；蛋白水解物；秀麗隱桿線蟲；生物學(xué)活性

植物蛋白質(zhì)及其水解物可應(yīng)用于飼料、食品和健康產(chǎn)品等[1]。相較于蛋白質(zhì)，蛋白水解物一般有更好的生物可吸收性[2]。已有玉米、綠豆、核桃等種子蛋白水解物的研究[2-4]和苜蓿、花椰菜、桑椹等葉蛋白水解物的研究[5-7]。相較于種子，植物葉的資源更豐富和更經(jīng)濟，但葉的蛋白含量明顯低于種子的蛋白含量，且葉中含有較多的多糖、多酚和色素等成分，導(dǎo)致葉蛋白普遍較難提取[8]。堿提酸沉法可用于大量提取葉蛋白，但其最適的料液比和堿提、酸沉pH值等提取參數(shù)因植物不同而異，需進(jìn)行有針對性的優(yōu)化[9]。此外，在制備植物蛋白水解物的過程中，也需通過超濾等方法分離出水解物更具代表性的活性組分[10]。

植物源蛋白水解物有多種生物學(xué)活性，如從大豆、桑椹和當(dāng)歸中制備的蛋白水解肽分別具有典型的抗腫瘤、抗氧化和抗衰老的活性[7,11-12]。來源于不同植物(特別是遠(yuǎn)親緣關(guān)系植物)中的蛋白水解物一般會呈現(xiàn)較大的序列差異性[13]?；谛蛄袥Q定活性，為分離出活性更典型的蛋白水解物，有必要在更多科屬來源的和更多地域特色的植物中開展蛋白水解物研究。

植物葉蛋白的提取方法主要有苯酚提取法、TCA/丙酮提取法、TCA/丙酮/苯酚提取法及堿提酸沉法[12,14]。前3種方法多用于蛋白質(zhì)組等微量蛋白試驗分析[12]；堿提酸沉法適于規(guī)?；崛〉鞍踪|(zhì)及其后續(xù)的水解肽制備與活性評估。有研究[5,15-16]采用堿提酸沉法提取水稻胚乳蛋白、黑豆蛋白和苜蓿葉蛋白，經(jīng)酶解制備水解肽后進(jìn)一步分析其生物學(xué)活性。在制備蛋白質(zhì)水解物過程中，常用的蛋白酶有胰酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶[4,9-10,17-18]。相對而言，后3種酶因易購、經(jīng)濟和產(chǎn)物多樣性高等應(yīng)用更普遍。

廣東省現(xiàn)有堇菜屬植物20余種。長萼堇菜(Blume)是其中資源最豐富的品種[19-20]。長萼堇菜的活性肽和代謝產(chǎn)物具有典型的抗炎、抗菌和抗氧化活性[19,21]。前期研究[19-20]解析了長萼堇菜的短序列cDNA譜和轉(zhuǎn)錄組，進(jìn)而從該植物中鑒定了一系列活性肽。長萼堇菜轉(zhuǎn)錄組編碼數(shù)以萬計的蛋白序列，這些蛋白的人工酶解，有望釋放出序列組成豐富多樣的蛋白水解物。目前，關(guān)于堇菜科植物葉蛋白水解物的組分及活性鮮見報道。

本研究中，采用堿提酸沉法提取長萼堇菜葉蛋白，并優(yōu)選最適料液比和堿提、酸沉pH值，采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解葉蛋白，采用超濾分離出不同分子量范圍的組分，評估不同組分潛在的抗氧化活性、抑癌細(xì)胞活性與延長線蟲壽命活性，旨在優(yōu)化長萼堇菜葉蛋白水解物的制備方法，明確蛋白水解物的活性及其組分差異，以期促進(jìn)長萼堇菜的人工栽培和開發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料為廣州大學(xué)城正常土壤生長的草本植物長萼堇菜。

1.2　方法

1.2.1長萼堇菜葉蛋白的提取和酶解

采用堿提酸沉法[5]提取長萼堇菜葉蛋白。利用Glycine-SDS-PAGE電泳檢測分析不同料液比(1∶8、1∶9和1∶10)、堿提pH值(8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5)和酸沉pH值(4.5、5.0和5.5)對葉蛋白提取結(jié)果的影響。參照文獻(xiàn)[22]的方法，用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶(索萊寶)水解長萼堇菜葉蛋白；利用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測分析酶解效果。堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶水解的長萼堇菜葉蛋白水解物分別記為APHr、FPHr和PPHr。

1.2.2蛋白水解物的超濾分離與抗氧化分析

根據(jù)蛋白酶解結(jié)果，參照文獻(xiàn)[23-24]的方法，采用膜超濾法分離APHr、FPHr和PPHr，其中相對分子質(zhì)量小于1×103的分別記為APH1、FPH1和PPH1，相對分子質(zhì)量為1×103~＜3×103的分別記為APH2、FPH2和PPH2，相對分子質(zhì)量大于等于3×103的分別記為APH3、FPH3、PPH3。將各組水解物凍干，備用。采用DPPH法[25-26]分析各組水解物的抗氧化活性，以還原性谷胱甘肽(GSH)為陽性對照。

1.2.3蛋白水解物的固相萃取與HPLC分析

基于增加水解物序列多樣性的考慮，先將超濾分離的3種酶促水解物組分依據(jù)同一相對分子質(zhì)量范圍條件等比例預(yù)混成3個組分，相對分子質(zhì)量由小到大，分別記為PH1、PH2、PH3，再用于固相萃取(SPE)脫鹽、HPLC分析和活性分析。利用C18固相萃取柱脫鹽純化超濾分離組分，洗脫液用氮吹儀濃縮后凍干，備用。采用分析型HPLC(LC3000，創(chuàng)新通恒)色譜法[2]比較不同組分的水解物，評估超濾分離效果。HPLC條件：分析柱型號為依利特SinoChrom 300A(10 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A相為5%乙腈/0.1% 三氟乙酸，B相為90%乙腈/0.1%三氟乙酸。

1.2.4細(xì)胞和線蟲試驗

采用CCK8法[27]分析不同終質(zhì)量濃度(0.00、0.02、0.10 mg/mL)的PH1、PH2、PH3對腫瘤細(xì)胞(人骨肉瘤143B細(xì)胞)的抑制活性，其中，以順鉑(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照。采用標(biāo)準(zhǔn)方法[28]培養(yǎng)野生型秀麗隱桿線蟲()和同步化，選取L4期線蟲分析蛋白水解物對線蟲壽命的影響。

1.3　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

運用Microsoft Excel 2016、Graph Pad Prism 8和SPSS 19.0分析試驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行組間差異分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　料液比和堿提與酸沉pH值對長萼堇菜葉蛋白提取的影響

從圖1的1~3泳道可以看出，3種料液比提取的葉蛋白濃度相近。考慮到蛋白提取的穩(wěn)定性和經(jīng)濟性，在后續(xù)的比較試驗中，料液比定為1∶9。從4~9泳道可以看出，堿提pH值為10.0時，葉蛋白濃度相對較高。從10~12泳道可以看出，酸沉pH值為4.5時，蛋白條帶相對較清晰。從13~15泳道可以看出，以料液比1∶9、堿提pH值10.0和酸沉pH值4.5的參數(shù)組合，可穩(wěn)定提取長萼堇菜葉蛋白。

M　預(yù)染蛋白Marker；1~3　液料比分別為1∶8、1∶9、1∶10時提取的蛋白；4~9　堿提pH值分別為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5時提取的蛋白；10~12　酸沉pH值分別為4.5、5.0、5.5時提取的蛋白；13~15　優(yōu)選條件下提取的3組葉蛋白。

2.2　3種蛋白酶對長萼堇菜葉蛋白的水解效果

從圖2可知，3種酶促水解產(chǎn)物均以相對分子質(zhì)量小于3.3×103的含量較多。基于此，選擇通過2種超濾膜進(jìn)一步從原初水解物(APHr、FPHr、PPHr)中分離出不同相對分子質(zhì)量范圍的組分。

M　多肽Marker；A　APHr；F　FPHr；P　PPHr。

2.3　長萼堇菜葉蛋白水解物的抗氧化活性

從圖3可知，不同水解物組分的抗氧化活性與其使用劑量呈正相關(guān)，與其相對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)。相對分子質(zhì)量小于1×103的水解物組分的抗氧化活性最強；3種酶解產(chǎn)生的相對分子質(zhì)量小于1×103的水解物組分的抗氧化活性間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。使用劑量為0.04~0.16 mg/mL時，同等劑量的PPH1、APH1和FPH1對DPPH的清除率差異極顯著(<0.01)。APH1對DPPH清除的IC50值(4.08×10-3mg/mL)極顯著低于PPH1的(3.41×10-1mg/mL)和FPH1的(2.60×10-1mg/mL)。這一結(jié)果應(yīng)歸因于3種酶對葉蛋白的不同酶切位點能釋放不同序列組成的蛋白水解物。

圖3　長萼堇菜葉蛋白水解物對DPPH的清除率

2.4　長萼堇菜葉蛋白水解物的超濾分離效果

如圖4所示，在前10 min，PH1只有1個主要的色譜峰，而PH2和PH3各有2個明顯的色譜峰。這應(yīng)歸因于PH2和PH3的相對分子質(zhì)量范圍大于PH1的?？梢?，用反相HPLC色譜法檢測PH1、PH2和PH3，可快速定性分析長萼堇菜葉蛋白水解物組分的超濾分離效果。

圖4　不同相對分子質(zhì)量范圍的長萼堇菜葉蛋白水解物的HPLC分析結(jié)果

2.5　長萼堇菜葉蛋白水解物的抗腫瘤細(xì)胞活性

從圖5可知，不同水解物組分對143B細(xì)胞活力的抑制作用低于化療藥物5-Fu和DDP的，但仍表現(xiàn)出一定的抑制活性；3組水解物的抗腫瘤細(xì)胞活性均與其使用劑量呈正相關(guān)，與其相對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)，PH1的抗腫瘤細(xì)胞活性最強。

圖5　長萼堇菜葉蛋白水解物對腫瘤細(xì)胞活性的抑制作用

2.6　長萼堇菜葉蛋白水解物的延長線蟲壽命活性

如圖6所示，未添加水解物的線蟲組中，線蟲存活時間低于25 d；添加PH1、PH2和PH3的線蟲組中，水解物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL組的延壽效應(yīng)整體優(yōu)于0.02 mg/mL組的，且最大存活時間分別是28、28、26 d，PH1和PH2對線蟲壽命的延長作用優(yōu)于PH3的。

圖 6　添加長萼堇菜葉蛋白水解物后的線蟲壽命

3　結(jié)論與討論

本研究中，采用堿提酸沉法成功制備了長萼堇菜葉蛋白。在使用該方法提取不同植物的蛋白時，依據(jù)起始材料性質(zhì)的不同，最適的料液比、堿提pH值和酸沉pH值會有相應(yīng)的差異。苜蓿干草為原料的最適料液比、堿提pH和酸沉pH分別為1∶35、10和4.2[29]；甘薯鮮葉為原料的最適料液比、堿提pH和酸沉pH分別為1∶4、8.0和4.5[30]；牡丹籽餅為原料的最適料液比、堿提pH和酸沉pH分別為1∶12、8.5和4.0[31]。本研究優(yōu)選的提取長萼堇菜葉蛋白最適的料液比、堿提pH和酸沉pH分別為1∶9、10.0和4.5，均介于上述文獻(xiàn)所用的參數(shù)數(shù)值范圍內(nèi)。

在來源于植物的蛋白質(zhì)水解物中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的典型活性成分主要在相對分子質(zhì)量小于等于3×103的組分中[5,15,23]。本研究中，長萼堇菜葉蛋白的3種酶促水解產(chǎn)物均以相對分子質(zhì)量小于3.3×103的含量較多。在抗氧化方面，已從大米、小麥、核桃、板栗和紫蘇等植物中鑒定出有較強抗氧化活性的蛋白水解肽，同時也發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量小于1×103的肽段的抗氧化能力顯著強于相對分子質(zhì)量大于3×103的多肽和蛋白質(zhì)組分的[2,15,23-24,26]。本研究中，長萼堇菜葉蛋白水解物中相對分子質(zhì)量小于1×103的組分具有最優(yōu)的抗氧化活性，與上述研究結(jié)果一致。

在抗腫瘤方面，部分植物的蛋白水解物已被發(fā)現(xiàn)有明顯的抑瘤效應(yīng)[11,32-33]。大豆蛋白水解物能顯著抑制2種腫瘤細(xì)胞(HeLa和C-3)的活性，IC50值分別為2.15、2.27 mg/mL[11]。從嘉蘭()根莖蛋白水解物中純化的相對分子質(zhì)量約為3×103的多肽對SW620細(xì)胞具有抑制活性[32]。本研究中，長萼堇菜葉蛋白水解物對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制活性，以相對分子質(zhì)量小于1×103的組分的抑制效果相對最優(yōu)。

在抗衰老方面，從當(dāng)歸蛋白水解物中分離的多肽組分(約20 aa)[12]和從玉米中分離的二肽(TA)[34]均可延長線蟲壽命?？寡趸瘎┍徽J(rèn)為具有延壽效應(yīng)[35]，同時蛋白水解肽的抗氧化活性也被認(rèn)為涉及對線蟲的延壽機制[12]。本研究中，長萼堇菜葉蛋白水解物中的組分PH1和PH2對秀麗隱桿線蟲壽命的延長作用和抗氧化活性均優(yōu)于組分PH3的，表明蛋白水解物組分的抗衰老活性與抗氧化活性呈正相關(guān)。

綜上可知，在長萼堇菜葉蛋白水解物組分中，相對分子質(zhì)量小于1×103的組分具有更好的應(yīng)用開發(fā)潛力。

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Preparation and activity analysis ofBlume leaf protein hydrolysates

XI Xueling1,2, YANG Mingting1,2, QIN Ting1,2, LIAO Bin3, ZHANG Jun1,2*

(1.School of Biosciences and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou, Guangdong 510006, China; 2.Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates, Guangzhou, Guangdong 510006, China; 3.School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong 510275, China)

Blume was purified using the optimized alkali extraction and acid precipitation method. Leaf protein hydrolysates were prepared by enzymatic method. The components of leaf protein hydrolysates were separated by ultrafiltration, and their antioxidant activities were analyzed. The isolated hydrolysate components were desalted by solid phase extraction, evaluated by HPLC analysis, and assayed the inhibitory activities to tumor cells along with the effects on lifespan of nematodes.leaf proteins could be stably extracted with the optimized parameters(ratio of material to liquid 1∶9, pH value of alkali extraction 10.0, and pH value of acid precipitation 4.5). The three selected proteases(papain, basic protease and flavor enzyme) could make most of hydrolysates with relative molecular weight less than 3.3×103, and ultrafiltration could isolate the groups of hydrolysate components with molecular weight of <1×103(PH1), 1×103-<3×103(PH2) and ≥3×103(PH3), respectively. The antioxidant activity and anticancer activity of the component PH1 were better than those of other components. PH1 and PH2 had similar effects on lifespan of nematodes, but both were superior to PH3. Therefore, the component PH1 ofleaf protein hydrolysates had more application and development value.

Blume; leaf proteins; protein hydrolysates;; biological activity

TQ936.1；TQ464.7

A

1007-1032(2020)06-0716-07

習(xí)雪玲，楊茗婷，覃婷，廖斌，張軍．長萼堇菜葉蛋白水解物的制備及其活性分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(6)：716-722．

XI X L, YANG M T, QIN T, LIAO B, ZHANG J. Preparation and activity analysis ofBlume leaf protein hydrolysates[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 716-722.

http://xb.hunau.edu.cn

2020-06-28

2020-07-24

國家自然科學(xué)基金項目(31570506)；廣東藥科大學(xué)創(chuàng)新強校項目(2017KCXTD020)

習(xí)雪玲(1992—)，女，湖北襄陽人，碩士研究生，主要從事植物活性肽研究，2296510646@qq.com；*通信作者，張軍，博士，副教授，主要從事鄉(xiāng)土植物資源研究，lsszhangj@gdpu.edu.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.013

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正