水稻OsFRK1與OsFRK2基因CRISPR敲除突變體的構(gòu)建

張宗飛，劉媛媛，歐陽(yáng)解秀，李紹波，王鑫

水稻與基因CRISPR敲除突變體的構(gòu)建

張宗飛，劉媛媛，歐陽(yáng)解秀，李紹波，王鑫*

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

為揭示水稻果糖激酶(OsFRK)家族基因的生物學(xué)功能，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功創(chuàng)建了2個(gè)已鑒定了的水稻OsFRK家族基因的敲除突變體；獲得28株的T0代轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率、突變率與純合突變率分別為100%、46.43%和10.71%；獲得14株的T0代轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率、突變率與純合突變率分別為92.86%、92.86%和21.43%；T0代敲除純合突變體中目的蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域均發(fā)生不同程度的破壞。

水稻；OsFRK家族基因；CRISPR/Cas9技術(shù)；載體構(gòu)建；敲除突變體

果糖激酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及逆境適應(yīng)中具有重要的功能，屬于pfkB碳水化合物激酶家族中的一類亞家族[1-2]。該類酶具有高度保守的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和果糖底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[3-4]。在植物中，對(duì)番茄的果糖激酶基因的功能研究比較深入，KANAYAMA等[5]從番茄中克隆到了4個(gè)果糖激酶基因、、和，這4個(gè)同源基因位于不同的染色體上，在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。基因下調(diào)表達(dá)，突變體的花期延遲，說(shuō)明基因與花期的調(diào)控有關(guān)[6]；基因在花粉發(fā)育的后期和花粉萌發(fā)期間在花藥中特異性表達(dá)，表明這種酶可能是參與花粉管發(fā)育過(guò)程中所必需的碳水化合物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥家族基因?qū)ΨN子油的積累與維管的發(fā)育非常重要[8]。基因在玉米響應(yīng)短期鹽脅迫過(guò)程中上調(diào)表達(dá)[9]；在甜菜()的根中，檢測(cè)到傷口應(yīng)激反應(yīng)中FRK活性增加[10]。說(shuō)明FRK在維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境適應(yīng)過(guò)程中都具有重要的功能。

水稻中，目前已鑒定了2個(gè)家族基因，分別為和[11]。有研究結(jié)果表明，在無(wú)氧條件下，水稻幼苗中的基因表達(dá)上調(diào)，基因表達(dá)下調(diào)[12]。GUGLIELMINETTI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇處理后水稻基因在幼苗的胚與胚芽鞘中的表達(dá)上調(diào)，基因下調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果暗示了和很有可能參與了水稻響應(yīng)氧脅迫的作用過(guò)程，但還需要進(jìn)一步證實(shí)。

本研究擬利用成熟的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[14]，構(gòu)建水稻和的敲除表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化法、靶點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析等方法創(chuàng)建和的CRISPR敲除表達(dá)突變體，為深入研究和的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

粳稻‘中花11’由江西省分子生物學(xué)與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑有KOD-Plus (TOYOBO)、酶(TransGen)、限制性內(nèi)切酶Ⅰ(NEB)、T4DNA ligase (NEB)、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)和質(zhì)粒小提中量試劑盒(TIANGEN)等。

1.2　實(shí)驗(yàn)菌株與載體

大腸埃希菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌EHA105購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司；CRISPR/Cas9載體構(gòu)建的pYLCRISPR-Cas9Pubi-H(MH)及sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建所需的啟動(dòng)子載體pYLsgRNA-OsU6a和pYLsgRNA-OsU6b由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光惠贈(zèng)。

1.3　CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

在Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)分別下載水稻(LOC_ Os01g66940)和(LOC_Os08g02120)基因組序列、mRNA序列和氨基酸序列；隨后在CRISPR-P網(wǎng)站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)上，以NGG為PAM結(jié)構(gòu)，分別在目的基因的第1個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)特異性的pYLCRISPR/Cas9靶點(diǎn)；并利用SMART在線網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/ smart/batch.pl?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg)對(duì)這2個(gè)家族基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；進(jìn)而在CRISPR-GE網(wǎng)站(http://skl.scau.edu.cn/)對(duì)已設(shè)計(jì)出的靶點(diǎn)進(jìn)行脫靶預(yù)測(cè)分析[15]，挑選出編輯效率較高、脫靶可能性較低且位于蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列上的靶點(diǎn)，并根據(jù)特異性靶點(diǎn)的特性設(shè)計(jì)靶點(diǎn)接頭引物。

1.4　CRISPR/Cas9 敲除表達(dá)載體的構(gòu)建

參考MA等[14]的方法構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除表達(dá)載體。先進(jìn)行靶點(diǎn)接頭的制備，再采用Ⅰ對(duì)sgRNA 啟動(dòng)子載體進(jìn)行酶切，其中選擇pYLsgRNA-OsU6b啟動(dòng)子載體，選擇pYLsgRNA-OsU6a和pYLsgRNA-OsU6b 2個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行第1輪PCR。各取1 μL第1輪PCR產(chǎn)物，用ddH2O稀釋10倍，作為第2輪PCR的模板。采用30 μL體系進(jìn)行sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建，加入0.5 μL第2輪PCR引物(最終濃度0.167 μmol/L)，使用適量的KOD-Plus進(jìn)行巢式PCR。程序設(shè)置為20個(gè)循環(huán)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s。將第1輪與第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，成功之后再把包含特異性靶點(diǎn)的sgRNA 表達(dá)盒的第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，成功構(gòu)建sgRNA 表達(dá)盒。采用Gold Gate cloning方法[16]，將其與pYLCRISPR/Cas9骨架載體同時(shí)進(jìn)行酶切-酶連；取5 μL產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證；最后再利用質(zhì)粒小提中量試劑盒提取相應(yīng)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒。

1.5　水稻組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化

采用凍融法[17]，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性菌加入含卡那霉素和利福平抗生素的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。參考前人建立的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系[18]，完成敲除載體的遺傳轉(zhuǎn)化。首先，利用成熟的粳稻‘中花11’種子經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得結(jié)構(gòu)致密、呈淡黃色的愈傷組織；挑選硬實(shí)的胚性愈傷組織于預(yù)培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)3 d后進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化；將浸染處理后的愈傷組織接種到篩選培養(yǎng)基(9 cm方皿)中，培養(yǎng)約1個(gè)月；將新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織移至分化培養(yǎng)基中，分化處理約1個(gè)月后長(zhǎng)出幼苗；將幼苗去根后移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d左右，獲得根系發(fā)達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗，經(jīng)過(guò)練苗處理后，移至大田中正常生長(zhǎng)。

1.6　水稻葉片基因組DNA的提取

采用CTAB法[19]提取水稻T0代材料的葉片基因組DNA。T0代幼苗移栽大田后15 d，每棵植株剪取0.2 g葉片于2 mL離心管中(加有直徑0.4 cm的不銹鋼珠)，加入800 μL 的CTAB 提取液(含β-巰基乙醇)，置于DNA-extractor (高通量組織球磨儀)上，打碎3 min，重復(fù)2 次；65 ℃水浴處理30 min；采用氯仿、異戊醇(氯仿與異戊醇的體積比為24∶1)溶液進(jìn)行抽提，隨后利用無(wú)水乙醇進(jìn)行DNA沉淀；獲得DNA沉淀后，再用ddH2O溶解，最后采用超微量分光光度計(jì)(Thermo Nanodrop 2000)對(duì)DNA溶液進(jìn)行檢測(cè)。

1.7　敲除突變體材料的鑒定

因CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建的骨架載體MH的T-DNA插入?yún)^(qū)包含有潮霉素抗性基因(HPT)序列，通過(guò)Addgene質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.addgene.org/)獲取MH載體的序列，再將序列導(dǎo)入SnapGene軟件中自動(dòng)識(shí)別出載體的HPT序列，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)并驗(yàn)證，以確定敲除載體的T-DNA區(qū)是否插入到水稻基因組中。在靶點(diǎn)上、下游各200 bp區(qū)段附近設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證[20]，其中只需設(shè)計(jì)1對(duì)引物就可將雙靶點(diǎn)序列擴(kuò)增在內(nèi)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Geneious軟件進(jìn)行比對(duì)分析，以此鑒定突變體的靶點(diǎn)序列突變情況。采用Geneious軟件進(jìn)行突變體的氨基酸序列分析，先將突變后的CDS序列導(dǎo)入Geneious軟件中，進(jìn)行翻譯，即可看到氨基酸序列的變化情況，再與粳稻‘中花11’編碼蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的序列進(jìn)行對(duì)比，可知保守結(jié)構(gòu)域是否遭到破壞。

2　結(jié)果與分析

2.1　OsFRK1和OsFRK2敲除靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)與獲取

在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中下載和的基因序列，利用CRISPR-P和CRISPR-GE在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)最佳的靶點(diǎn)(圖1)，在基因的第1個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了1個(gè)敲除靶點(diǎn)，由OsU6b啟動(dòng)；在基因的第1個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了2個(gè)敲除靶點(diǎn)，分別由OsU6a和OsU6b啟動(dòng)。最后針對(duì)以上特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的靶點(diǎn)接頭引物(表1)。

圖1　OsFRK1和OsFRK2的CRISPR/Cas9敲除靶點(diǎn)序列與位置

表1　本研究所用的引物

表1(續(xù))

2.2　OsFRK1和OsFRK2敲除表達(dá)載體的構(gòu)建

參考MA等[14]的方法，首先成功構(gòu)建了sgRNA表達(dá)盒，其2輪巢式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖2-A、圖2-B)顯示，第2輪PCR產(chǎn)物OsFRK1-OsU6b- gRNA、OsFRK2-OsU6a-gRNA、OsFRK2-OsU6b- gRNA電泳條帶大小與預(yù)期的基本相符，分別為485 bp、599 bp和485 bp；隨后把純化回收的靶標(biāo)sgRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cass9骨架載體同時(shí)進(jìn)行酶切-酶連反應(yīng)；產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌后，經(jīng)菌落PCR鑒定，獲得陽(yáng)性單菌落(圖2-C、圖2-D)，其中圖2-C中的泳道2~4為敲除表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性單菌落，泳道1為假陽(yáng)性；圖2-D中除泳道10為假陽(yáng)性單菌落外，其余的皆為敲除表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性單菌落。分別挑取3個(gè)不同的陽(yáng)性單菌落進(jìn)行測(cè)序和NCBI的Blastn比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)期的特異性靶點(diǎn)序列已成功裝載，由此確定成功構(gòu)建了和的CRISPR敲除表達(dá)載體。

M DNA Marker；H2O 空白對(duì)照；MH pYLCRISPR/Cas9-MH質(zhì)粒。A 泳道1、2為OsFRK1-OsU6b第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3為OsFRK1-OsU6b第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物；B 泳道4、5為OsFRK2-OsU6a第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6、7為OsFRK2-OsU6b第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道8、9為OsFRK2-OsU6b第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物；C 泳道1~5為OsFRK1 基因敲除單菌落；D 泳道6~13為OsFRK2基因敲除單菌落。

2.3　水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

成功獲得CRISPR/Cas9敲除表達(dá)載體后，利用凍融法將其轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株(圖3)。最終獲得28株基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株和14株基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株。這些轉(zhuǎn)基因植株移至大田種植后的存活率均為100%。

A　水稻愈傷組織的誘導(dǎo)；B　農(nóng)桿菌浸染前愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)；C　浸染后的共培養(yǎng)；D　愈傷組織的篩選培養(yǎng)；E　愈傷組織的分化培養(yǎng)；F　T0代組培苗的生根培養(yǎng)。

2.4　T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

在轉(zhuǎn)基因幼苗移栽至大田15 d后，提取其葉片基因組DNA，對(duì)其轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性率和敲除突變情況進(jìn)行鑒定。對(duì)潮霉素抗性基因()進(jìn)行PCR擴(kuò)增條帶檢測(cè)(圖4)，其中擴(kuò)增片段大小為733 bp；若無(wú)條帶，則表明無(wú)T-DNA插入。

M　DNA Marker；泳道1　H2O 空白對(duì)照；泳道2　野生型‘中花11’；泳道3~30　OsFRK1轉(zhuǎn)基因潮霉素抗性苗；泳道31~44　OsFRK2轉(zhuǎn)基因幼苗。

對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)顯示，28株為T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為100%；13株為T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，其陽(yáng)性率為92.86%。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序分析，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株突變率為46.43%，純合突變率為10.71%，同時(shí)獲得2種純合突變體材料，分別是osfrk1-2/17(堿基C缺失)和osfrk1-14(堿基CGC缺失且由C突變?yōu)锳)；轉(zhuǎn)基因植株突變率為92.86%，純合突變率為21.43%，也獲得2種純合突變體材料，分別是osfrk2-5/7(靶點(diǎn)1處插入堿基T；靶點(diǎn)2處缺失堿基C)和osfrk2-9(靶點(diǎn)2處插入堿基A)；純合突變體的測(cè)序結(jié)果沒(méi)有雜峰(圖5)。

表2　OsFRK1和OsFRK2的T0代轉(zhuǎn)基因植株的敲除效率

A、B、C 分別為OsFRK1b、OsFRK2a 和OsFRK2b 靶點(diǎn)序列測(cè)序結(jié)果。

進(jìn)一步對(duì)純合突變體進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)：所獲得的T0代純合突變體材料的蛋白功能結(jié)構(gòu)域都遭到不同程度的破壞，osfrk1-2/17的靶位點(diǎn)序列缺失C堿基，導(dǎo)致之后的氨基酸序列發(fā)生移碼突變，翻譯提前終止；osfrk2-5/7在靶點(diǎn)a處增添T堿基，導(dǎo)致天冬氨酸(D)直接突變?yōu)榻K止密碼子，嚴(yán)重破壞了目的蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

灰色部分序列為目的蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；紅色序列代表突變體發(fā)生突變后的序列。

3　結(jié)論與討論

有研究[21]表明，優(yōu)化Cas9基因表達(dá)的啟動(dòng)子，可以提高基因組編輯的效率。在擬南芥中，由PcUbi4-2驅(qū)動(dòng)Cas9基因時(shí)，T1代轉(zhuǎn)基因植株突變效率低至26%[22]，而改為YAO啟動(dòng)子時(shí)，擬南芥基因組的突變率高達(dá)88.5~90.5%[23]。MA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中用PZmUbi啟動(dòng)Cas9基因，表達(dá)效果最佳，T0代轉(zhuǎn)基因植株的突變率高達(dá)85.4%。本研究中，采用PZmUbi啟動(dòng)的CRISPR/Cas9技術(shù)成功創(chuàng)建了與的T0代轉(zhuǎn)基因植株，它們的突變率分別為46.43%和92.86%，其純合突變率分別為10.71%和21.43%，說(shuō)明了PZmUbi啟動(dòng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻基因組的編輯效率較高。

前人研究結(jié)果表明，在擬南芥和番茄中，F(xiàn)RK家族基因的表達(dá)變化會(huì)影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育[5-8]；在玉米、向日葵和甜菜等植物中，F(xiàn)RK家族基因表現(xiàn)出對(duì)多種非生物脅迫具有顯著的響應(yīng)[9-10]。說(shuō)明FRK家族基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境適應(yīng)中具有重要的生物學(xué)功能。本研究中，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建了與的敲除突變體，獲得了13株敲除突變體T0代植株，并且在2個(gè)基因的T0代敲除突變體中均獲得了2種不同突變類型的純合突變體，為進(jìn)一步探究和的生物學(xué)功能提供了遺傳材料。

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Generation of CRISPR knock-out mutantsof theandin rice

ZHANG Zongfei, LIU Yuanyuan, OUYANG Jiexiu, LI Shaobo, WANG Xin*

(College of Life Sciences, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China)

To reveal the biological function of fructokinase (OsFRK) family genes in rice, two knock-out mutants for identified OsFRK family genes were constructed using CRISPR/Cas9 technology. The results showed that 28and 14T0transgenic plants were successfully constructed. The transgenic positive rate, mutation rate and homozygous mutation rate ofis 100%, 46.43% and 10.71%, whileis 92.86%, 92.86% and 21.43%. In addition, the functional domains of targeted proteins of the T0knock-out homozygous mutants were damaged in the mutatnts.

; OsFRK family genes; CRISPR/Cas9; vector construction; knock-out mutants

S511；Q789

A

1007-1032(2020)06-0679-07

張宗飛，劉媛媛，歐陽(yáng)解秀，李紹波，王鑫．水稻與基因CRISPR敲除突變體的構(gòu)建[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(6)：679-685．

ZHANG Z F, LIU Y Y, OUYANG J X, LI S B, WANG X. Generation of CRISPR knock-out mutants of theandin rice[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2020, 46(6): 679-685.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-12-09

2020-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31760080、31960422)

張宗飛(1993—)，男，廣東茂名人，碩士研究生，主要從事水稻遺傳學(xué)研究，zzf520cn@163.com；*通信作者，王鑫，博士，講師，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，wangxin@ncu.edu.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.007

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正