以癲首發(fā)的顱內(nèi)海綿狀血管瘤患兒內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體細(xì)胞間黏附分子?1表達(dá)研究

李斌 周輝 金愛(ài)琴

顱內(nèi)海綿狀血管瘤（CCM）是一種先天性顱內(nèi)血管畸形病變，約50%患者以癲為首 發(fā) 癥 狀［1］。該病可發(fā)生于任何年齡，但兒童患者尤其是以癲為首發(fā)癥狀的患兒常因表達(dá)不完全或不能配合相關(guān)檢查而被誤診，因而不能得到及時(shí)有效的治療，導(dǎo)致嚴(yán)重后果［2?3］。因此，尋找新的具有快速診斷意義的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要臨床意義。細(xì)胞間黏附分子?1（ICAM?1）屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，可介導(dǎo)炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，在冠心病和腦出血等疾病的監(jiān)測(cè)中具有潛在的臨床應(yīng)用前景［4?5］，其血清水平變化可作為診斷和監(jiān)測(cè)海綿狀血管瘤療效的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，血清ICAM?1變化極易受微環(huán)境等外界因素的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)呈假陰性或假陽(yáng)性［6］。外泌體是由細(xì)胞分泌的膜性囊泡樣物質(zhì)，可在血清中長(zhǎng)時(shí)間存在，其表面蛋白質(zhì)表達(dá)穩(wěn)定，分泌后極少受到外界環(huán)境因素的影響，故在疾病診斷和治療過(guò)程中具有重要作用［7?9］。研究表明，于磁珠表面包被 CD63 抗體，可特異性捕獲血液循環(huán)中的外泌體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體表面蛋白質(zhì)的表達(dá)變化即可準(zhǔn)確而迅速地確定血清ICAM?1含量，而且價(jià)格低廉，目前已有相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)，應(yīng)用于疾病的快速診斷和監(jiān)測(cè)［10］，本文擬對(duì)外泌體ICAM?1在顱內(nèi)海綿狀血管瘤致兒童癲診斷中的作用進(jìn)行觀察，并探討其發(fā)生機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、觀察對(duì)象

1.納入與排除標(biāo)準(zhǔn) （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀與腦電圖檢查均符合2001年國(guó)際抗癲聯(lián)盟（ILAE）癲分類中有關(guān)原發(fā)性癲的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；MRI顯示網(wǎng)狀混雜信號(hào)，周圍呈明顯T2WI低信號(hào)圈；年齡＞18歲；患兒家屬對(duì)檢查項(xiàng)目及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)知情并簽署知情同意書(shū)。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并以下疾病者均非本研究觀察對(duì)象，包括惡性腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）或乙型病毒性肝炎等感染性疾病、先天性心臟病等遺傳性疾病，以及冠心病或血管炎等其他心血管疾病。

2.一般資料 根據(jù)上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇2014年2月至2019年2月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科就診的癲患兒共40例，根據(jù)其臨床表現(xiàn)和影像學(xué)是否合并顱內(nèi)海綿狀血管瘤，分為單純癲發(fā)作組（癲組）和海綿狀血管瘤相關(guān)性癲組（CCM組），每組各20例。兩組患兒均以癲為首發(fā)癥狀，腦電圖表現(xiàn)為散在或連續(xù)出現(xiàn)的棘波節(jié)律或雙側(cè)對(duì)稱性同步棘?慢綜合腦電異常信號(hào)，癲組部分性發(fā)作6例、全面性強(qiáng)直?陣攣發(fā)作14例，CCM組部分性發(fā)作4例、全面性強(qiáng)直?陣攣發(fā)作16例。CCM組患兒T1WI呈低信號(hào)、T2WI呈高信號(hào)，在控制癲發(fā)作后均行單純海綿狀血管瘤切除手術(shù)。選擇20例同期在我院進(jìn)行體格檢查的健康兒童作為正常對(duì)照（對(duì)照組），對(duì)三組受試者性別、年齡、體重參數(shù)進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1），均衡可比。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)材料 （1）血液標(biāo)本：采集各組受試者手部靜脈血1 ml，分離血清并置于?80℃冰箱保存，用于血清外泌體ICAM?1的檢測(cè)。（2）試劑與藥品：人內(nèi)皮細(xì)胞系（EC?304，3～5代）和巨噬細(xì)胞系（U937，3～5代）由美國(guó)American Type Culture Collection公司提供。外泌體?人CD63分離/檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó) Invitrogen 公司。小鼠抗人 CD63?PE、CD31?APC和ICAM?1?FITC單克隆抗體為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，ICAM?1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒由深圳欣博盛生物科技有限公司提供。無(wú)外泌體血清、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，以及脂多糖（LPS）分別購(gòu)于美國(guó)Hyclone或Sigma公司。Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。（3）儀器與設(shè)備：LSRFortessa X?20流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司提供，TG16KR高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海繼譜電子科技有限公司。

表1 三組受試者社會(huì)人口學(xué)資料的比較Table 1. Comparison of sociodemographic data of the subjects in 3 groups

2.檢測(cè)方法 （1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清外泌體表達(dá)變化：將三組受試者外周血分別置15 ml離心管，離心半徑10 cm、1500 r/min高速離心10 min，取上清液，滴加 5 μl免疫磁珠 CD63，室溫孵育 4 h；置磁力架上1 min以結(jié)合血清中的外泌體，棄上清液。上述實(shí)驗(yàn)步驟共重復(fù)3次，然后分別滴加CD63（2 μl）、CD31（5 μl）和 ICAM?1（5 μl）流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)抗體，室溫避光孵育1 h，置磁力架上1 min，棄上清液。重復(fù)3次后滴加150 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD31+外泌體表面ICAM?1表達(dá)水平，CD63+代表免疫磁珠所捕獲的為外泌體。（2）ELISA試驗(yàn)檢測(cè)血清ICAM?1表達(dá)變化：采用ELISA試劑盒檢測(cè)三組患兒血清ICAM?1水平，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。（3）組織病理觀察：采集CCM組患兒手術(shù)切除標(biāo)本，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定、石蠟包埋，制備厚度為3 μm的海綿狀血管瘤組織切片，每一標(biāo)本共制備3張腦組織切片，分別行HE染色、ICAM?1和CD68免疫組化染色，檢測(cè)海綿狀血管瘤組織ICAM?1表達(dá)和CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況；以染色呈紫色或黑色者為免疫組化表達(dá)陽(yáng)性。（4）細(xì)胞培養(yǎng)：內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分別置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10 ng/ml LPS以模擬炎癥環(huán)境，刺激48 h后收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。（5）細(xì)胞共培養(yǎng)：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)4～6 d，于Transwell共培養(yǎng)小室內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。然后，采集呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞（20×103），以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶1 ml消化2 min，平均傳代至24孔板下室，細(xì)胞貼壁后PBS沖洗（×3）并分為對(duì)照組（加入相同體積PBS）、共培養(yǎng)組（Transwell上室加入巨噬細(xì)胞）、LPS組（Transwell上室加入經(jīng)LPS預(yù)刺激巨噬細(xì)胞）、白細(xì)胞介素?6（IL?6）阻斷組（Transwell上室加入經(jīng)LPS預(yù)刺激巨噬細(xì)胞+IL?6中和性抗體），以及腫瘤壞死因子α（TNF?α）阻斷組（Transwell上室加入LPS預(yù)刺激巨噬細(xì)胞+TNF?α中和性抗體）。培養(yǎng)48 h后去上室細(xì)胞、PBS連續(xù)沖洗（×3），滴加體積分?jǐn)?shù)10%不含外泌體血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體表面ICAM?1表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

3.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較行Bonferroni法；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析行Spearman秩相關(guān)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ELISA檢測(cè)顯示，各組受試者血清ICAM?1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.751，P=0.489；表2）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，經(jīng)磁珠分離獲得的外泌體95%以上表達(dá)CD63，表明外泌體純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、癲組和CCM組患兒血清CD31+外泌體比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.356，P=0.708）；對(duì)照組與癲組患兒CD31+外泌體ICAM?1平均熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.016，P=0.334）；與癲組相比，CCM組患兒CD31+外泌體ICAM?1平均熒光強(qiáng)度增加85.60%［（24.77±3.90）%對(duì)（45.97± 5.06）%；t=3.317，P=0.008；表3，4］。

免疫組化染色顯示，海綿狀血管瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM?1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)目為11.20個(gè)/視野，且ICAM?1平均光密度與巨噬細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)（rs=0.909，P=0.001），提示巨噬細(xì)胞可能是引起海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM?1表達(dá)增強(qiáng)的主要機(jī)制。

與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組外泌體表面ICAM?1平均熒光強(qiáng)度增加 25.61%［（164.81±7.00）%對(duì)（207.03± 9.18）%；t=3.652，P=0.004］，而LPS組外泌體表面ICAM?1平均熒光強(qiáng)度則進(jìn)一步增加，相對(duì)于共培養(yǎng)組增加 71.13%［（354.31±18.22）%對(duì)（207.03 ± 9.18）%；t=7.212，P=0.000］；經(jīng) IL?6和TNF?α阻斷后，可使部分外泌體ICAM?1表達(dá)水平下降，與LPS組相比，分別降低27.72%［（256.06±11.38）%對(duì)（354.31 ± 18.22）%；t=4.570，P=0.001］和29.97%［（248.11±10.02）%對(duì)（354.31±18.22）%；t=5.105，P=0.000；表5，6］。

表2 三組受試者血清ICAM?1表達(dá)水平的比較（±s，ng/ml）Table 2. Comparison of serum ICAM?1 levels in 3 groups(±s,ng/ml)

表2 三組受試者血清ICAM?1表達(dá)水平的比較（±s，ng/ml）Table 2. Comparison of serum ICAM?1 levels in 3 groups(±s,ng/ml)

CCM，intracranial cavernous hemangioma，顱內(nèi)海綿狀血管瘤；ICAM?1，intercellular adhesion molecule?1，細(xì)胞間黏附分子?1。The same for Table 3

組別對(duì)照組癲images/BZ_92_358_740_383_769.png組例數(shù)20 20 20 CCM組F值P值ICAM?1 14.55±1.56 16.80±1.87 20.72±2.21 0.751 0.489

表3 三組受試者血清CD31+外泌體ICAM?1表達(dá)變化的比較（±s，%）Table 3. Comparison of changes in serum CD31+exosome ICAM?1 expression among subjects in 3 groups(±s,%)

表3 三組受試者血清CD31+外泌體ICAM?1表達(dá)變化的比較（±s，%）Table 3. Comparison of changes in serum CD31+exosome ICAM?1 expression among subjects in 3 groups(±s,%)

組別對(duì)照組（1）癲images/BZ_92_1007_834_1033_863.png例數(shù)2 0 2 0 2 0組（2）C C M組（3）C D 3 1+?I C A M?1 1 9.8 0±2.9 2 2 4.7 7±3.9 0 4 5.9 7±5.0 6 F值P值1 1.7 3 1 0.0 0 1

表5 各組受試者巨噬細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體ICAM?1表達(dá)水平的比較（±s，%）Table 5. Comparison of the expression levels ofICAM ?1 in exosomes promoted by macrophages in different groups(±s,%)

表5 各組受試者巨噬細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體ICAM?1表達(dá)水平的比較（±s，%）Table 5. Comparison of the expression levels ofICAM ?1 in exosomes promoted by macrophages in different groups(±s,%)

LPS，lipopolysaccharides，脂多糖；IL?6，interleukin?6，白細(xì)胞介素?6；TNF?α，tumor necrosis factor?α，腫瘤壞 死 因 子 ?α；ICAM ?1，intercellularadhesion molecule?1，細(xì)胞間黏附分子?1

例數(shù)組別對(duì)照組（1）共培養(yǎng)組（2）LPS組（3）IL?6阻斷組（4）TNF?α阻斷組（5）F值P值ICAM?1 164.81± 7.00 207.03± 9.18 354.31±18.22 256.06±11.38 248.11±10.02 35.802 0.000 6 6 6 6 6

表6 不同組別巨噬細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體ICAM?1表達(dá)變化的兩兩比較Table 6. Pairwise comparison of the changes of ICAM?1 expression in exosomes promoted by macrophages in different groups

討 論

外泌體在細(xì)胞信號(hào)交流和行使功能的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是目前最具發(fā)展前景的臨床檢測(cè)技術(shù)［14?16］，通過(guò)檢測(cè)外泌體蛋白質(zhì)表面細(xì)胞程序性死亡蛋白1（PD1）等分子的表達(dá)，可以預(yù)測(cè)人體內(nèi)是否發(fā)生腫瘤，以及針對(duì)腫瘤細(xì)胞所實(shí)施治療的效果［17］。由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的各種外泌體均具有促進(jìn)血管生成和調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用［18］，本研究海綿狀血管瘤相關(guān)性癲組患兒外周血CD31+外泌體蛋白表面ICAM?1表達(dá)顯著高于單純癲組患兒，相對(duì)于單純外周血細(xì)胞因子，外泌體具有更高的穩(wěn)定性，不易受內(nèi)環(huán)境因素的影響。已知在外泌體表面存在一些特異性較強(qiáng)的分子，其表達(dá)穩(wěn)定，是一種較好的外泌體來(lái)源性標(biāo)志物，本研究采用CD31對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行標(biāo)記，顯示出良好的可重復(fù)性和臨床應(yīng)用價(jià)值。

ICAM?1廣泛存在于機(jī)體組織器官，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答等重要功能［19?20］，目前 ICAM?1 更多用于評(píng)價(jià)心肌梗死、支氣管擴(kuò)張、惡性腫瘤或腎小球腎炎等疾病的嚴(yán)重程度［21］。與上述疾病相比，顱內(nèi)海綿狀血管瘤尤其是隱匿性海綿狀血管瘤病變區(qū)域狹小、局限，因此根據(jù)外周血ICAM?1表達(dá)變化預(yù)測(cè)海綿狀血管瘤嚴(yán)重程度的臨床價(jià)值尚存爭(zhēng)議，由于納入標(biāo)準(zhǔn)不同，使得各項(xiàng)研究的結(jié)論也存在較大差異。本研究結(jié)果表明，外泌體ICAM?1預(yù)測(cè)海綿狀血管瘤相關(guān)性癲具有臨床篩查和診斷價(jià)值；而其表達(dá)變化與巨噬細(xì)胞比例呈正相關(guān)，后者主要通過(guò)分泌IL?6和TNF?α等炎性因子而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放ICAM?1表達(dá)陽(yáng)性外泌體，炎癥反應(yīng)越強(qiáng)、外泌體ICAM?1表達(dá)水平越高，提示外周血巨噬細(xì)胞數(shù)目可作為評(píng)價(jià)ICAM?1表達(dá)的指標(biāo)。

綜上所述，CD31+外泌體ICAM?1在顱內(nèi)海綿狀血管瘤相關(guān)性癲患兒外周血中呈高表達(dá)，而巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體ICAM?1的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，其深入的病理生理學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但筆者認(rèn)為外泌體ICAM?1的表達(dá)變化，可作為海綿狀血管瘤相關(guān)性癲患兒的新的篩查指標(biāo)。

利益沖突 無(wú)