影響胃癌總體生存率的免疫相關(guān)基因篩選*

胡仁旺， 龔建平

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院胃腸外科，武漢 430030

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，治療方式以手術(shù)切除為主。近年來的研究發(fā)現(xiàn)胃癌的預(yù)后不僅與病理分期有關(guān)，還與腫瘤微環(huán)境具有明顯的相關(guān)性[1-3]。腫瘤微環(huán)境主要包括腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等。越來越多的文獻證實免疫細(xì)胞的浸潤是影響胃癌預(yù)后的重要因素，因此篩選影響胃癌預(yù)后的免疫相關(guān)基因具有重要意義[4]。TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫包含各種腫瘤完整的臨床信息和基因測序信息[5-6]，且其數(shù)據(jù)信息及患者隨訪信息處于不斷更新狀態(tài)。ImmPort(The Immunology Database and Analysis Portal)數(shù)據(jù)庫[7-8]是最常用的免疫相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫之一，其中包含大量已經(jīng)鑒別出來的免疫相關(guān)基因，因此可以通過R軟件將TCGA數(shù)據(jù)庫和ImmPort數(shù)據(jù)庫結(jié)合起來篩選出影響胃癌術(shù)后總體生存率的免疫相關(guān)基因。本研究將篩選出來的免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及腫瘤純度等腫瘤微環(huán)境的相關(guān)指標(biāo)進行相關(guān)性分析，探討其影響腫瘤預(yù)后的機制，并通過生物富集分析了解基因的相關(guān)表達通路，以此深入了解胃癌免疫相關(guān)基因的功能，以期更好地指導(dǎo)臨床工作。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌患者的臨床信息和基因表達信息，將臨床信息和基因表達信息合并，刪除缺失值。通過ImmPort免疫數(shù)據(jù)庫獲取免疫相關(guān)基因列表，并提取對應(yīng)的免疫相關(guān)基因在胃癌患者中的表達量。

1.2 研究流程

首先利用數(shù)據(jù)庫信息篩選出胃癌患者的癌旁組織和腫瘤組織之間具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達基因，且差異表達在2倍以上。然后利用Kaplan-Meier法在差異表達基因中篩選出影響胃癌患者預(yù)后的基因,并與通過單因素COX回歸分析篩選出來的臨床指標(biāo)進行合并，再進行多因素COX回歸分析，篩選出獨立預(yù)后的風(fēng)險基因。對篩選出來的風(fēng)險基因進行與臨床病理、免疫細(xì)胞浸潤、腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性分析和基因信號通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計計算均通過R軟件完成，生存分析采用Kaplan-Meier法，2個指標(biāo)之間的比較采用Wilcox檢驗法(如腫瘤組織和癌旁組織之間基因表達量的比較)，3個及以上指標(biāo)之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗法(如單個基因在腫瘤不同T分期患者之間的比較)，臨床相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。圖形繪制均用R軟件完成，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入病例的臨床資料及篩選出的基因信息

通過數(shù)據(jù)整理及基因與臨床信息的合并，刪除缺失值后，最終納入患者313例，其中男性198例，女性115例。Grade分級：Ⅰ級7例，Ⅱ級108例，Ⅲ級198例。T分期：T1期15例，T2期64例，T3期151例，T4期83例。M分期：M0期292例，M1期21例。N分期：N0期94例，N1期86例，N2期69例，N3期64例。篩選出胃癌腫瘤組織和癌旁組織之間差異表達的免疫相關(guān)基因345個，其中對胃癌術(shù)后總體生存率有影響的基因有20個(CGB5、INHBB、TMSB15A、DKK1、GDF7、SLC22A17、GHR、MMP12、PGF、FGFR4、IGHV3-35、INHBA、IGHD3-16、IGLV3-22、MASP1、BMP8A、CARD11、NOX4、NPR3、IGHA1)。

2.2 臨床指標(biāo)的單因素COX回歸分析

如圖1所示，通過對臨床指標(biāo)進行單因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)：年齡[HR=1.020，95%CI：1.003～1.037，P=0.019]、T分期[HR=1.369，95%CI：1.102～1.702，P=0.005]、M分期[HR=2.502，95%CI：1.435～4.365，P=0.001]和N分期[HR=1.349，95%CI：1.155～1.575，P<0.01]為影響胃癌預(yù)后的風(fēng)險因素。

圖1 臨床指標(biāo)單因素COX回歸分析Fig.1 Univariate COX regression analysis of clinical indexes

2.3 多因素COX回歸分析

將影響患者預(yù)后的臨床指標(biāo)(年齡、T分期、M分期、N分期)與影響患者術(shù)后生存率的20個免疫相關(guān)基因合并進行多因素COX回歸分析。如圖2所示：臨床指標(biāo)中，年齡[HR=1.054，95%CI：1.030～1.078，P<0.01]、M分期[HR=2.596，95%CI：1.217～5.537，P=0.014]和N分期[HR=1.276，95%CI：1.050～1.551，P=0.014]為影響胃癌術(shù)后的獨立風(fēng)險因素。在基因指標(biāo)中：NOX4基因[HR=3.008，95%CI：1.706～5.306，P<0.01]、SLC22A17基因[HR=1.087，95%CI：1.024～1.154，P=0.007]和DKK1基因[HR=1.003，95%CI：1.000～1.007，P=0.039]為影響胃癌預(yù)后的獨立風(fēng)險因素，且這3個基因的表達量越高，患者預(yù)后越差。

圖2 多因素COX回歸分析Fig.2 Multivariate COX regression analysis

2.4 預(yù)后免疫相關(guān)基因?qū)颊呖傮w生存率的影響

如圖3所示：高表達NOX4基因(χ2= 4.2，P=0.041)、SLC22A17基因(χ2= 6.6，P=0.010)、DKK1基因(χ2= 7.4，P=0.007)患者的術(shù)后總體生存率明顯低于低表達組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 預(yù)后免疫相關(guān)基因生存曲線Fig.3 Survival curves of prognostic immune-related genes

2.5 預(yù)后免疫相關(guān)基因表達量分析

如圖4所示：在腫瘤組織中NOX4基因、DKK1基因表達量明顯高于正常組織(均P<0.05)，而SLC22A1基因在腫瘤組織中表達量的中位值低于正常組織(P<0.01)。

2.6 預(yù)后免疫相關(guān)基因與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過R軟件，采用Kruskal-Wallis檢驗方法對病理分級和病理分期(T、N、M)進行檢驗。NOX4、SLC22A17、DKK1基因的表達在N分期和M分期中均無統(tǒng)計學(xué)差異，因此未繪制圖形。如圖5所示：在T分期中，隨著T分期的進展NOX4基因和SLC22A17基因表達量有逐漸增高趨勢，而DKK1基因在T2和T3期的基因表達量相對較高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。在病理分級中，NOX4基因和SLC22A17基因在不同病理分級中表達不同，但沒有明顯的上升趨勢，DKK1基因表達在各病理分級中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 預(yù)后免疫相關(guān)基因在正常組織和腫瘤組織的表達量Fig.4 Expression of prognostic immune-related genes in normal and tumor tissues

圖5 預(yù)后免疫相關(guān)基因與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of the correlation between prognostic immune-related genes and clinicopathological indexes

2.7 預(yù)后免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞浸潤量的相關(guān)性分析

通過TIMER免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)庫[9-10]探索NOX4、SLC22A17及DKK1基因與免疫細(xì)胞浸潤量的相關(guān)性，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。如表1所示：NOX4基因表達與B細(xì)胞浸潤量、CD8+T細(xì)胞浸潤量、CD4+T細(xì)胞浸潤量、巨噬細(xì)胞浸潤量、中性粒細(xì)胞浸潤量和樹突狀細(xì)胞浸潤量之間均具有明顯相關(guān)性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。SLC22A17基因表達量與B細(xì)胞浸潤量、CD8+T細(xì)胞浸潤量、CD4+T細(xì)胞浸潤量、巨噬細(xì)胞浸潤量、中性粒細(xì)胞浸潤量和樹突狀細(xì)胞浸潤量之間均具有明顯相關(guān)性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。DKK1基因表達量與CD8+T細(xì)胞浸潤量和巨噬細(xì)胞浸潤量之間具有明顯相關(guān)性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 預(yù)后免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞浸潤量的相關(guān)性分析Table 1 Analysis of the relationship between prognostic immune-related genes and immune cell infiltration

2.8 預(yù)后免疫相關(guān)基因與腫瘤微環(huán)境相關(guān)性分析

基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，通過R語言“estimate”包采用“ESTIMATE”免疫評分算法[11]對基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞進行評分，并計算其與NOX4、SLC22A17及DKK1基因表達的相關(guān)性，相關(guān)性方法也采用Spearman相關(guān)系數(shù)法。如表2所示：NOX4基因表達量與基質(zhì)細(xì)胞評分、免疫細(xì)胞評分及總評分之間均呈正相關(guān)(P<0.01)。SLC22A17基因與基質(zhì)細(xì)胞評分、免疫細(xì)胞評分及總評分之間也均呈正相關(guān)(P<0.01)。而DKK1基因表達與腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞均無相關(guān)關(guān)系。

表2 預(yù)后免疫相關(guān)基因與腫瘤微環(huán)境相關(guān)性分析Table 2 Analysis of the relationship between prognostic immune-related genes and tumor microenvironment

2.9 免疫相關(guān)基因的通路富集分析

通過R軟件“org.Hs.eg.db”包對影響胃癌術(shù)后總體生存率的20個基因進行GO(Gene Ontology)通路富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。將20個基因全部納入后，富集分析分析的通路相對更為準(zhǔn)確且同時可以縮小尋找NOX4、SLC22A17及DKK1基因通路的研究范圍。通過GO富集分析(BP、CC、MF分別代表生物過程、細(xì)胞組成、分子功能3種富集分析方法)發(fā)現(xiàn)346條有統(tǒng)計學(xué)意義的基因通路；通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)7條有統(tǒng)計學(xué)意義的基因通路。篩選各種富集分析方法中有意義的前10條基因通路繪制圖6。從圖中可知與預(yù)后相關(guān)的免疫相關(guān)基因可能與細(xì)胞因子生物合成過程的調(diào)控(regulation of cytokine biosynthetic process)、細(xì)胞因子代謝過程(cytokine metabolic process)和細(xì)胞因子受體間相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等基因通路具有一定相關(guān)性。

圖6 GO、KEGG基因通路富集分析Fig.6 Gene pathway enrichment analysis by GO and KEGG

3 討論

免疫相關(guān)基因是指通過研究鑒別出來的與免疫反應(yīng)個別通路或部分通路明顯相關(guān)的基因。本研究通過Kaplan-Meier法篩選出來的20個與免疫相關(guān)的基因，均影響胃癌患者的術(shù)后總體生存率，通過GO和KEGG生物富集分析，我們也發(fā)現(xiàn)這些影響腫瘤預(yù)后的基因表達量與多條細(xì)胞因子通路和免疫突觸具有明顯的相關(guān)性。通過多因素COX回歸分析，我們篩選出3個影響胃癌預(yù)后的獨立風(fēng)險基因：NOX4、SLC22A17和DKK1基因。其中NOX4基因(NADPH Oxidase 4，NADPH氧化酶4)有研究表明其可依賴脂肪酸氧化促進巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活[12]。在胃癌中通過RNAi介導(dǎo)的NOX4沉默調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲[13]，也可誘導(dǎo)通過GLI1途徑調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡[14]。在通過GO法富集到的346條有統(tǒng)計學(xué)意義的基因通路中，與NOX4基因相關(guān)的有45條，其中還與DNA生物合成的調(diào)控(positive regulation of DNA biosynthetic process)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控(positive regulation of protein serine/threonine kinase activity)等信號通路明顯相關(guān)。目前關(guān)于SLC22A17基因(solute carrier family 22 member 17，溶質(zhì)載體家族蛋白22成員17)在胃癌中的研究尚未見文獻報道，但有文獻表明，SLC22A17基因與脂鈣蛋白2(lipocalin2，Lcn2)基因協(xié)同參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲過程[15]。通過上文分析我們發(fā)現(xiàn)SLC22A17基因在腫瘤組織中表達量的中位值低于正常組織(P<0.01)。這在基因與腫瘤預(yù)后的研究中也是非常常見的現(xiàn)象，因為SLC22A17基因為蛋白編碼基因，mRNA基因高表達并不代表著蛋白水平高表達，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，對于促癌基因在腫瘤中的基因表達水平也可能低于正常組織。通過富集分析我們發(fā)現(xiàn)SLC22A17基因與輔因子輸運(cofactor transport)通路具有明顯的相關(guān)性。而對于DKK1基因(dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，Dickkopf-Wnt信號通路抑制劑1)，單純從基因的命名上來看我們就知道DKK1基因與Wnt信號通路具有明顯的相關(guān)性，通過富集分析，我們發(fā)現(xiàn)與DKK1基因表達具有明顯相關(guān)的信號通路有100條，而與Wnt信號通路有相關(guān)性的有4條，分別為：非典型Wnt信號通路的正調(diào)控(positive regulation of non-canonical Wnt signaling pathway)、Wnt信號通路與細(xì)胞極性通路(regulation of Wnt signaling pathway，planar cell polarity pathway)、非典型Wnt信號通路的調(diào)控(regulation of non-canonical Wnt signaling pathway)、Wnt信號通路與鈣調(diào)節(jié)通路(Wnt signaling pathway，calcium modulating pathway)。通過檢索文獻我們發(fā)現(xiàn)DKK1基因與MIR-493基因相互作用，共同調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲[16]。也有文獻表明DKK1基因受啟動子甲基化的調(diào)控，影響膽汁酸誘導(dǎo)的胃黏膜腸化生[17]。因此，基于DKK1基因的免疫調(diào)控作用，有學(xué)者研究證明，抗DKK1的抗體DKN-01可以作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤的治療[18]。

腫瘤免疫治療是近年來研究的熱點[19]，最常見且較易檢測的免疫細(xì)胞包括6種：B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀狀細(xì)胞。通過TIMER免疫數(shù)據(jù)庫對NOX4、SLC22A17和DKK1基因與免疫細(xì)胞浸潤量進行相關(guān)性研究，我們發(fā)現(xiàn)NOX4和SLC22A17基因表達量與這6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性均具有統(tǒng)計學(xué)意義，DKK1基因表達量與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤量的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，這也再次說明了篩選出來的3個獨立預(yù)后的免疫相關(guān)基因與腫瘤免疫密切相關(guān)。同時我們也發(fā)現(xiàn)這3個基因在胃癌患者中均與巨噬細(xì)胞的浸潤量具有明顯相關(guān)性，這一結(jié)論與很多文獻一致[20-22]。目前很多文獻的研究結(jié)果均表明胃癌患者的預(yù)后與巨噬細(xì)胞的浸潤量明顯相關(guān)。

胃癌患者的術(shù)后總體生存率是由多項臨床指標(biāo)和基因表達共同影響的[23]，近年來越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境也是影響腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素[24]。通常腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞[25]、免疫細(xì)胞及各種細(xì)胞因子[26]共同組成，這些組成部分之間相互作用,生物學(xué)過程復(fù)雜[27]。通常以腫瘤純度評估腫瘤細(xì)胞含量的多少，腫瘤純度一般與基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過本研究我們也發(fā)現(xiàn)NOX4基因和SLC22A17基因與免疫細(xì)胞評分、基質(zhì)細(xì)胞評分及二者相加的總評分之間均呈正相關(guān)(均P<0.01)。因此也說明了NOX4基因和SLC22A17基因?qū)ξ赴┗颊呖傮w生存率的影響，可能也有免疫系統(tǒng)的作用。

總之，本研究使我們加深了對胃癌的免疫相關(guān)基因的認(rèn)識，同時也篩選出了所有影響預(yù)后的風(fēng)險免疫相關(guān)基因。通過對免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、基因通路的進一步探索，也為我們的下一步研究明確了方向，對胃癌的免疫治療具有一定的臨床意義。