外泌體在骨骼肌損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展

周 敏 李秉樞 劉 成 洪莎莎 胡 鳴 閔 潔 湯劍明 洪 莉

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430060

骨骼肌損傷是一種常見(jiàn)的臨床損傷性疾病，通常是由外力直接作用導(dǎo)致骨骼肌纖維挫傷和撕裂或間接作用牽拉損傷肌纖維所致。骨骼肌損傷后修復(fù)不良可造成機(jī)體肌肉功能障礙，嚴(yán)重影響患者的日常生活。目前，關(guān)于骨骼肌損傷性疾病的治療方法均存在明顯的問(wèn)題，因此迫切需要探索更有效的新型療法[1]。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的納米級(jí)胞外囊泡，因其在不同生理狀態(tài)下差異性攜帶內(nèi)容物，近年來(lái)在疾病診斷與治療領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。研究表明，外泌體參與骨骼肌纖維的正常生長(zhǎng)發(fā)育和損傷后再生過(guò)程，可作為骨骼肌損傷性疾病的一種新型療法，不僅能取得較好的治療效果，還可以避免并發(fā)癥[2-3]。本文總結(jié)了外泌體在骨骼肌損傷修復(fù)領(lǐng)域的國(guó)內(nèi)外最新研究成果，從外泌體的生物學(xué)特性、功能及在骨骼肌損傷性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 外泌體生物學(xué)特性及功能

外泌體是一種粒徑在30～150 nm 之間的脂質(zhì)雙層膜胞外囊泡，存在于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞及體液[4]。外泌體內(nèi)富含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及氨基酸和代謝產(chǎn)物。2007 年Valadi 等[5]首次發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)含有生物活性的信使RNA（mRNA）和微小RNA（miRNA/miR），將小鼠來(lái)源的外泌體與人細(xì)胞系共培養(yǎng)，結(jié)果在人細(xì)胞系中檢測(cè)到一些小鼠蛋白，而這些蛋白在小鼠外泌體中僅以mRNA 的形式存在，表明mRNA 通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且被翻譯成蛋白質(zhì)[6]。因此，外泌體被認(rèn)為是一種新型的分子水平轉(zhuǎn)移媒介，可以將其載荷的內(nèi)容物運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞且影響受體細(xì)胞的功能，在細(xì)胞間“通訊”中發(fā)揮重要作用。

外泌體具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。首先，外泌體可作為一種新型的疾病預(yù)測(cè)及診斷手段。隨著生理狀況的變化，外泌體分泌量及其內(nèi)容物會(huì)顯著不同，根據(jù)其內(nèi)特定的蛋白或miRNA 可預(yù)測(cè)、診斷及預(yù)后疾病[7]。研究者已證實(shí)通過(guò)檢測(cè)血清外泌體miR-1246 水平可診斷侵襲性前列腺癌及預(yù)測(cè)該病情的進(jìn)展[8]。其次，外泌體可作為藥物的運(yùn)輸載體。由于外泌體的磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，其可以通過(guò)藥物難以逾越的生物屏障，同時(shí)避免局部炎癥和免疫排斥反應(yīng)，將外泌體作為藥物運(yùn)輸載體，既能實(shí)現(xiàn)臨床疾病的靶向治療，又可以延長(zhǎng)藥物的半衰期。目前，外泌體通過(guò)遞送化學(xué)藥物在癌癥、炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域的作用得到有效證實(shí)[9]。外泌體還可以通過(guò)攜帶特定RNA分子在基因水平治療疾病。Tao 等[10]通過(guò)外泌體使沉默RNA 結(jié)合到腫瘤細(xì)胞，引起目標(biāo)mRNA 沉默，抑制消化系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)。由此，外泌體在臨床治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 骨骼肌損傷修復(fù)的反應(yīng)過(guò)程

骨骼肌損傷后的修復(fù)過(guò)程可分為兩個(gè)階段，即炎癥反應(yīng)與修復(fù)重建階段。骨骼肌損傷初始為炎癥反應(yīng)階段，一般是傷后第1～2 天，肌纖維變性、壞死和周?chē)軓V泛破壞，促炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)包括炎癥因子和趨化因子釋放，促使外周循環(huán)中的中性粒細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)皮游出血管壁滲入受損區(qū)域，中性粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放促炎癥因子擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，同時(shí)募集促炎型巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等其他骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷部位發(fā)揮吞噬作用清除受損肌纖維等壞死組織碎片，此外，成纖維細(xì)胞、成纖維脂肪祖細(xì)胞等細(xì)胞也參與初始炎癥反應(yīng)的清除過(guò)程[11-12]。炎癥反應(yīng)后為修復(fù)階段，一般是傷后第3～6 天，免疫細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子及大分子蛋白如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和ECM 重塑基質(zhì)金屬蛋白酶等，激活靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞（statellite cell，SCs），產(chǎn)生ECM 趨化片段，同時(shí)促炎型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)為抗炎型巨噬細(xì)胞，參與調(diào)控SCs 與成肌細(xì)胞增殖與分化[13-14]。SCs 激活、増殖和分化形成新的肌管，然后與存活肌纖維融合，修復(fù)損傷肌纖維，同時(shí)產(chǎn)生新的ECM 包括肌內(nèi)膜、肌束膜和肌外膜[15]。若骨骼肌損傷嚴(yán)重且范圍過(guò)大，損傷處可見(jiàn)結(jié)締組織瘢痕形成和毛細(xì)血管再建，一般在損傷后第14 天，肌肉新生完成，再生骨骼肌成熟，ECM 經(jīng)歷重塑，瘢痕組織機(jī)化，骨骼肌損傷修復(fù)與再生完成[16]。

3 外泌體與骨骼肌損傷修復(fù)

骨骼肌的損傷修復(fù)中肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和肌源性分化是決定肌肉再生的最重要階段，此外細(xì)胞之間的相互作用同樣對(duì)骨骼肌纖維的再生至關(guān)重要。研究表明，在小鼠急性肌肉損傷模型中，肌纖維損傷后的最初幾小時(shí)以及損傷后的第5～7 天再生過(guò)程中循環(huán)外泌體均顯著增加，并且證實(shí)外泌體主要由損傷的肌纖維和肌肉再生相關(guān)的其他細(xì)胞產(chǎn)生[17]。因此，不同來(lái)源的外泌體在肌肉損傷修復(fù)中不同階段可能發(fā)揮著不可忽視的作用。目前，研究者對(duì)外泌體在骨骼肌損傷修復(fù)中的研究重點(diǎn)集中在其攜帶的內(nèi)容物，因此主要從以下3 個(gè)方面進(jìn)行闡述。

3.1 外泌體蛋白介導(dǎo)的骨骼肌損傷修復(fù)

骨骼肌損傷早期，肌膜破損后胞內(nèi)發(fā)生一系列急性反應(yīng)進(jìn)行肌動(dòng)蛋白重組和膜重塑以數(shù)分鐘內(nèi)輔助肌膜愈合，其中鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白A1 是肌膜損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白[18]。Bizzarro 等[19]證實(shí)外泌體內(nèi)富含的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白A1 通過(guò)作用甲酰基肽受體刺激成肌細(xì)胞增殖從而修復(fù)骨骼肌質(zhì)膜以促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)。除了對(duì)肌膜修復(fù)作用外，外泌體蛋白還在肌纖維損傷后的炎癥與抗炎過(guò)程中發(fā)揮作用。炎癥過(guò)程中伴隨炎癥因子釋放增多，肌管富含肌生成抑制蛋白的外泌體分泌增加，外泌體通過(guò)攜載的肌生成抑制蛋白抑制生肌決定因子和肌細(xì)胞生成素表達(dá)以及蛋白激酶B 和雷帕霉素靶蛋白介導(dǎo)的肌生成信號(hào)通路，同時(shí)增加成肌細(xì)胞環(huán)氧化酶2 的表達(dá)[20]。因此，在肌肉修復(fù)的早期炎癥反應(yīng)階段，外泌體通過(guò)其內(nèi)蛋白限制肌生成并促進(jìn)炎癥細(xì)胞清除受損組織。此外，再生抗炎階段，損傷的肌纖維還可以自分泌外泌體進(jìn)行修復(fù)。Forterre 等[21]發(fā)現(xiàn)，成肌細(xì)胞和肌管在肌肉分化過(guò)程中能夠分泌外泌體，且肌管釋放的外泌體中富含絲蛋白和肌聯(lián)蛋白等多種蛋白，隨后體外實(shí)驗(yàn)研究表明氧化損傷的肌管會(huì)釋放外泌體，并通過(guò)其蛋白抑制靶衛(wèi)星細(xì)胞中的肌細(xì)胞生成素表達(dá)，從而促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞增殖，加速損傷愈合[22]。Guescini 等[23]也證實(shí)，骨骼肌撕裂傷后自分泌富含肌原性生長(zhǎng)因子的外泌體，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向肌原性譜系分化以促進(jìn)肌肉損傷修復(fù)。

3.2 外泌體miRNA 介導(dǎo)的骨骼肌損傷修復(fù)

miRNA 在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用已得到廣泛研究，由于外泌體攜帶豐富的miRNAs，越來(lái)越多的研究揭示了各種細(xì)胞來(lái)源的外泌體miRNAs 參與骨骼肌的再生修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體內(nèi)富集miR-125b、miR-494 和miR-601，研究發(fā)現(xiàn)，這些miRNAs 可作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞，刺激其內(nèi)生肌決定因子和肌細(xì)胞生成素的表達(dá)增加，調(diào)控其增殖和分化，同時(shí)還可以減弱肌纖維化，提高毛細(xì)血管密度，加速損傷肌肉的再生[24-25]。SCs 源性外泌體可轉(zhuǎn)移其載荷的miR-1 至鄰近的SCs，通過(guò)改變其成肌相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)SC 分化[14]。SCs 源性外泌體還可以通過(guò)激活成纖維細(xì)胞、沉積和降解ECM 以及補(bǔ)充組織細(xì)胞來(lái)重塑受損組織。超負(fù)荷誘導(dǎo)的肌肉損傷模型中SCs 源性外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移其攜帶的miR-206 抑制鄰近的成纖維細(xì)胞核糖體結(jié)合蛋白-1 表達(dá)，從而抑制膠原蛋白和纖連蛋白的生成，輔助受損肌肉再生和重塑[26]。成熟肌管以及成肌細(xì)胞源性外泌體中同樣包含有多種與肌肉分化密切相關(guān)的miRNAs，如miR-133a和miR-133b，分別通過(guò)負(fù)調(diào)控成肌細(xì)胞中的Foxl2基因以及肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7 基因的表達(dá)促進(jìn)肌纖維再生[27-28]。骨骼肌去神經(jīng)損傷后，肌肉衍生的外泌體從miR-720 轉(zhuǎn)變?yōu)閙iR-206 富集狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)[29]。此外，高強(qiáng)度騎車(chē)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉損傷中，肌肉衍生的外泌體miR-208a 參與調(diào)節(jié)肌纖維類型[30]。上述研究表明，在骨骼肌損傷疾病中，不同來(lái)源外泌體特定的miRNAs 在損傷背景下選擇性裝載和釋放，參與肌纖維的再生和重塑。

3.3 外泌體其他內(nèi)容物介導(dǎo)的骨骼肌損傷修復(fù)

外泌體內(nèi)除miRNA 和蛋白之外還含有其他信息物質(zhì)。Yan 等[31]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以改善小鼠缺血性肌肉損傷后的血液灌注和肌力及延長(zhǎng)小鼠跑步距離，還能夠抑制局部缺血所致的炎癥小體引起細(xì)胞焦亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體是通過(guò)其內(nèi)環(huán)狀RNA-circHIPK3 靶向肌細(xì)胞miR-421/FOXO3a，從而抑制細(xì)胞焦亡和白細(xì)胞介素-1 等炎癥因子升高來(lái)修復(fù)骨骼肌缺血性損傷。Guescini 等[32]發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞可以釋放外泌體且其內(nèi)攜帶線粒體DNA，并推測(cè)線粒體DNA 可通過(guò)外泌體途徑進(jìn)入靶細(xì)胞線粒體，向靶細(xì)胞傳遞信號(hào)進(jìn)行調(diào)控，隨后的研究也證實(shí)了猜想，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的骨骼肌釋放的外泌體能夠誘導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞周期和分化相關(guān)基因的表達(dá)。此外，脂質(zhì)組學(xué)分析也表明外泌體攜帶的脂質(zhì)可在肌肉細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，外泌體可以作為“類旁分泌”信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)肌肉動(dòng)態(tài)平衡。

3 小結(jié)

外泌體是一種直徑在30～150 nm 并攜帶多種信息物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，其在骨骼肌損傷和修復(fù)過(guò)程中選擇性裝載內(nèi)容物，因此探究骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中外泌體的不同內(nèi)容物，可以針對(duì)疾病發(fā)生的不同時(shí)間段進(jìn)行優(yōu)化治療，大幅度改善患者的骨骼肌損傷情況。盡管外泌體在骨骼肌損傷性疾病臨床治療方面具有良好的應(yīng)用前景，但是不同來(lái)源外泌體內(nèi)復(fù)雜的信息物質(zhì)類別、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及作用機(jī)制等問(wèn)題仍未明確，且對(duì)于外泌體量化生產(chǎn)及儲(chǔ)存問(wèn)題還面臨一定的挑戰(zhàn)，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步探討。