術(shù)前聯(lián)合使用順鉑和中藥大黃素對(duì)人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響

肖仁斌

湘雅萍礦合作醫(yī)院腫瘤科，江西萍鄉(xiāng) 337000

在20世紀(jì)中期食管癌是一種不常見的癌癥，但自20世紀(jì)70年代以來，食管下段和胃食管交界處腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì)。食管癌（主要是鱗狀細(xì)胞癌）在世界部分地區(qū)，尤其是東亞地區(qū)廣泛流行，該病在早期沒有典型的臨床癥狀，因此大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)患有該疾病時(shí)已經(jīng)是中晚期[1-2]。根據(jù)全世界癌癥病例的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，食管癌的發(fā)病率和致死率在全世界全部癌癥發(fā)生率和致死率中分別排在第7 位和第6 位，且在我國(guó)該病的發(fā)生率和致死率是最高的[3]。當(dāng)前為延長(zhǎng)該類疾病患者的存活時(shí)間，臨床上通常采用手術(shù)切除、放化療、靶向治療以及免疫療法的聯(lián)合治療方案[4-5]。臨床相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在對(duì)患者進(jìn)行切除手術(shù)前進(jìn)行化療可延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，并提高其生活質(zhì)量[6]。順鉑是一種由氯原子和氨分子結(jié)合而形成的絡(luò)合物，可以有效抑制DNA 的復(fù)制階段，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有較好的抗癌作用[7]。而大黃素是中藥大黃、虎杖的主要活性成分，是一種蒽醌類衍生物，在臨床上具有抑制免疫活性、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及抗炎的功效，且其作為治療癌癥的藥物具有低毒性的較大優(yōu)勢(shì)，因此被醫(yī)護(hù)工作者廣泛關(guān)注[8-9]。相關(guān)研究表明，野生型p53基因是一種抑癌因子，其野生型p53 誘導(dǎo)基因1（wildtype p53-induced gene，WIG-1）可與癌細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[10]。本研究旨在分析術(shù)前聯(lián)合應(yīng)用西藥順鉑和中藥大黃素對(duì)人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在湘雅萍礦合作醫(yī)院2019年1月—2020年8月接受治療的120 例食管癌鱗癌患者作為研究對(duì)象，所有患者均采用西藥順鉑和中藥大黃素聯(lián)合用藥的方式進(jìn)行為期3 個(gè)療程的治療。根據(jù)術(shù)中所取病灶組織部位的不同，將其分為觀察組和對(duì)照組。觀察組術(shù)中取腫瘤病灶組織，對(duì)照組術(shù)中取距離腫瘤部位3 cm 以上的癌旁組織，每組各60 例。對(duì)照組患者中，男26 例，女34 例；年齡26～83 歲，平均（55.30±7.46）歲；腫瘤直徑1～9 cm，平均（4.49±0.85）cm；腫瘤生長(zhǎng)部位，上段25 例，中段19 例，下段16 例；臨床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期18 例。觀察組患者中，男31例，女29 例；年齡25～84 歲，平均（57.30±8.86）歲，腫瘤直徑1～9 cm，平均（4.63±0.69）cm；腫瘤生長(zhǎng)部位：上段22 例，中段20 例，下段18 例；臨床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期22 例，Ⅳ期19 例。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)湘雅萍礦合作醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合人食管鱗癌的臨床診斷要求，入院后經(jīng)過病理檢查確診為食管鱗癌；②經(jīng)體檢患者符合進(jìn)行手術(shù)治療的標(biāo)準(zhǔn)，且在進(jìn)行手術(shù)前聯(lián)合服用大黃素和順鉑無較大不良反應(yīng)，具有較好的耐受性；③患者及其家屬享有知情權(quán)，依從性較好，可以服從醫(yī)護(hù)人員的安排，完成相關(guān)檢查。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重肝、腎等基礎(chǔ)重大疾病患者；②有家族遺傳史、精神異常的患者；③入院時(shí)腫瘤已發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的患者。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

無菌操作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，4℃離心機(jī)（離心半徑15 cm），實(shí)時(shí)熒光定量分析儀，電泳儀、精密電子分析天平、pH 劑、恒溫加熱水浴鍋、高分辨光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀（Sartorius，USA）。

1.2.2 試劑

RNA 提取試劑盒，CYBR-GREEN 熒光劑，DEPC水、TaqDNA 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶（Thermofisher，Japan），TOX 酶、瓊脂糖、牛血清白蛋白，免疫組化試劑盒等（Sigma，USA）。

1.3 方法

所有患者在確診后，均接受大黃素（Sigma，貨號(hào)：E7881）聯(lián)合順鉑（山東齊魯制藥，生產(chǎn)批號(hào)：006013CF）的術(shù)前治療方案。

1.3.1 配制大黃素溶液

稱取大黃素?cái)?shù)十克，充分溶解于二甲基亞砜中，并用配套濾膜進(jìn)行無菌濾過，最終母液濃度為5 mg/mL，于-20℃冰箱中冷凍保存。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，將母液稀釋為30 μg/mL 以及60 μg/mL[11-12]。

1.3.2 病灶樣本采集

在3 個(gè)療程結(jié)束后對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)治療，在手術(shù)中取出患者的病灶組織和癌旁組織，溶于滅菌生理鹽水中，于-20℃冰箱中冷凍保存。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基將其稀釋為5 μg/mL 以及10 μg/mL[13]。

1.3.3 WIG-1 mRNA的表達(dá)

1.3.3.1 mRNA 提取 ①裂解液配制：巰基乙醇按體積比100∶1 進(jìn)行配制；②70%乙醇配制；③將待測(cè)樣本用37℃PBS 沖洗后，加入配制好的裂解液，渦旋使其充分溶解至液體澄清透明；④將全部液體轉(zhuǎn)移至藍(lán)色過濾柱，15 000g，離心2 min；⑤棄去藍(lán)色過濾柱，在濾液中加入等量70%乙醇，攪拌均勻；⑥轉(zhuǎn)移至紅色過濾柱中，15 000g，離心15 s；⑦棄去濾液，加入Wash Solution 1，500 μL，15 000g，離心15 s；⑧棄去濾液，加入Wash Solution 2，500 μL，15 000g，離心15 s；⑨將過濾柱轉(zhuǎn)移至新管中，加入洗脫液50 μL，15 000g，離心1 min；⑩應(yīng)用酶標(biāo)儀在260/280 nm 處對(duì)提取的mRNA 濃度及純度進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3.2 cDNA 合成 利用TaqDNA 合成酶對(duì)提取的mRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）測(cè)定 采用相對(duì)定量法對(duì)WIG-1 進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)標(biāo)基因?yàn)镚APDH，正向引物為5′-AGTGGGAAATCGCCTGTG-3′，反向引物為5′-CAGGGTACATTCGTGGTGC-3′。目標(biāo)基因WIG-1 正向引物為5′-CCAACTGTCTCCTCAGACCC-3′，反向引物為5′-CCTGGGCATCTATACAGTCC-3′?？偡磻?yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為：25℃，10 min；45℃，30 min；98℃，5 min。連續(xù)循環(huán)60 次。

1.4 觀察指標(biāo)

通過RT-PCR 測(cè)定結(jié)果比較兩組WIG-1 mRNA表達(dá)水平，并記錄觀察組手術(shù)前后食管鱗癌組織和癌旁組織中WIG-1 mRNA的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組WIG-1 mRNA 表達(dá)水平的比較

觀察組腫瘤組織的WIG-1 mRNA 表達(dá)水平為（0.79±0.14），高于對(duì)照組的（0.06±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.379，P<0.05）。

2.2 觀察組手術(shù)前后腫瘤組織WIG-1 mRNA 表達(dá)水平的比較

觀察組患者在接受手術(shù)后腫瘤組織的WIG-1 mRNA 表達(dá)水平為（0.24±0.04），低于術(shù)前的（0.79±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.150，P<0.05）。

3 討論

目前順鉑是用于治療癌癥較為常用的化療藥物之一，其可以較為有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床數(shù)據(jù)表明，順鉑用于治療人食管鱗癌的作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)p53 和p73 兩種細(xì)胞的凋亡通路進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14-15]。但其也具有較大的不良反應(yīng)，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，患者逐漸出現(xiàn)惡心、嘔吐等副作用，使其依從性減弱。因此聯(lián)合用藥成為目前治療的主流手段[16-17]。

大黃素是從中藥大黃等植物中提取的活性成分，可以有效清除體內(nèi)自由基，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的功效。相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)顯示，大黃素可以調(diào)節(jié)多種通路，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果[18]。本研究旨在分析聯(lián)合應(yīng)用西藥順鉑和中藥大黃素對(duì)人食管鱗癌WIG-1 mRNA的影響，結(jié)果顯示，觀察組腫瘤組織的WIG-1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且觀察組患者在接受手術(shù)后腫瘤組織的WIG-1 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示術(shù)前聯(lián)合使用順鉑和大黃素可降低人食管鱗癌WIG-1 mRNA的表達(dá)水平。

綜上所述，WIG-1 mRNA 基因在未發(fā)病組織中表達(dá)量較少，且在術(shù)前聯(lián)用西藥順鉑和中藥大黃素對(duì)食管鱗癌患者進(jìn)行治療有利于減少WIG-1 mRNA 基因的表達(dá)量，可較好地改善患者的預(yù)后，進(jìn)而為食管鱗癌的治療提供臨床及分子學(xué)依據(jù)。