抑制或基因敲除HDACs在不同視神經(jīng)損傷模型中神經(jīng)保護作用的研究進展

于坷鑫，孫河

青光眼是視神經(jīng)損傷疾病的典型代表之一，其主要病理特征是進行性、特異性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）丟失及由此引起的視野缺損。病理性眼壓升高對視神經(jīng)的機械性壓迫學說，以及視網(wǎng)膜和視神經(jīng)血流灌注異常的缺血學說，在青光眼發(fā)病機理中占據(jù)重要地位[1]。RGCs調(diào)亡則是青光眼長期漸進式視神經(jīng)損害的病理基礎，探索RGCs 的凋亡機制，特異性阻斷RGCs 的損傷過程，成為視神經(jīng)保護的關注要點。越來越多的證據(jù)[2-5]表明，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）的活性是神經(jīng)元死亡的重要原因之一，與亨廷頓氏病、中風和缺血性損傷、脊髓-小腦共濟失調(diào)7 型的動物模型以及可卡因?qū)е碌挠洃泦适в嘘P。近年來，HDACs 已被確定為是神經(jīng)退行性病變潛在的治療靶點，HDACs 抑制療法將成為青光眼視神經(jīng)損傷的未來治療策略。本文將具體闡述抑制或基因敲除HDACs 在不同視神經(jīng)損傷模型中神經(jīng)保護作用的研究進展。

1 組蛋白乙?；cHDACs

在真核細胞中，DNA 被高度保守的組蛋白H2A、H2B、H3和H4 包裹成核小體，形成染色質(zhì)的基本單位。染色質(zhì)重塑在基因表達調(diào)控中起著關鍵作用。表觀遺傳修飾可以在不改變DNA 序列的情況下調(diào)控可遺傳或可逆的基因表達，也可以改變?nèi)旧|(zhì)結構及其可塑性。DNA 甲基化和組蛋白翻譯后修飾（histone post-translational modification，PTM）是基因表達表觀遺傳調(diào)控的兩個主要機制。PTM 在化學上具有多樣化，包括乙酰化、磷酸化、泛素化、甲基化、ADP 核糖基化和生物素化[6]。其中，組蛋白乙酰化是影響基因轉(zhuǎn)錄的主要修飾，受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HATs）和HDACs 二者的動態(tài)調(diào)控。HATs 乙酰化組蛋白的賴氨酸，導致染色質(zhì)結構松散，也促進了基因的表達。相反，HDACs 從高度乙?；慕M蛋白中去除乙?；谷旧|(zhì)結構緊密，并抑制一般基因轉(zhuǎn)錄。除了影響基因表達外，HDACs 還能通過去乙酰化非組蛋白靶點底物而發(fā)揮作用，在細胞和系統(tǒng)水平上改變信號，并導致細胞分化和細胞類型的特異性效應。

在神經(jīng)病理條件下，HATs/HDACs 平衡的紊亂會導致染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄異常，進而對細胞的存活產(chǎn)生不利影響。事實[7]證明，神經(jīng)變性狀態(tài)所涉及到的主要的細胞死亡和功能缺失，皆與組蛋白乙?；蓙y有關。在高眼壓、視神經(jīng)損傷以及缺血缺氧等多種致病因素導致的神經(jīng)病理情況下，HATs 常常被降解，活性喪失，相比之下，HDACs 活性明顯增強，組蛋白乙酰化動態(tài)平衡活性被破壞，去乙酰化活動相對過度；伴隨此過程，HATs 形成的輔抑制因子和HDACs 形成的輔激活因子（均為一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物），進一步加劇去乙?；顒樱偈巩惾旧|(zhì)生成以及特異基因的沉默，從而導致神經(jīng)細胞的生理功能紊亂[8]。

2 HDACs 分類

已知哺乳動物細胞中有18 種HDACs，基于酵母HDACs的同源性劃分為4 類。Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDACs 是鋅依賴性酶，而Ⅲ類HDACs 是NAD+依賴性酶。由HDAC1，HDAC2，HDAC3 和HDAC8組成的Ⅰ類HDACs 在所有組織的細胞核中普遍表達。HDAC1 和HDAC2 主要是存在于核，而HDAC3和HDAC8 可以進出細胞核[9]，許多底物包括腫瘤抑制因子、類固醇受體及轉(zhuǎn)錄因子已被確認為是Ⅰ類HDACs 去乙?；牡孜?。Ⅱ類HDACs 與組織特異性功能相關，可使許多非組蛋白底物去乙酰化。Ⅱ類HDACs 又分為2 類：Ⅱa 類由HDAC4，HDAC5，HDAC7 和HDAC9組成；Ⅱb 類由HDAC6和HDAC10組成。Ⅱa 類HDACs 顯示核和細胞質(zhì)定位，以信號依賴的方式在核質(zhì)間穿梭[9-10]。Ⅱb 類HDACs 主要位于細胞質(zhì)中，主要作為信號轉(zhuǎn)導和運動的調(diào)節(jié)劑起作用，可使皮質(zhì)激素，熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）和微管蛋白去乙?；痆11]。HDAC11 是Ⅳ類HDACs 的唯一成員，與Ⅰ類和Ⅱ類HDACs 同源。對HDAC11 知之甚少，但已在腎臟、大腦、睪丸、心臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)有表達[12]，HDAC11 可通過抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育和白細胞介素-10 的表達[13]。Ⅲ類HDACs，也稱為Sirtuins，由SIRT 1-7組成。Sirtuins 在人體組織中廣泛表達，調(diào)節(jié)多種生物學功能，如氧化應激、DNA 修復、代謝和衰老[14]。

3 HDACs 抑制劑

HDAC 抑制劑（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）是一類天然的和合成的化合物，在臨床和實驗研究中具有不同的靶向特異性和活性[15]。HDACi 基于其結構大致分為4 類：異羥肟酸、環(huán)肽、苯甲酰胺和短鏈脂肪酸。美國FDA 批準的抗癌HDACi 中的3 種是異羥肟酸，包括伏立諾他（vorinostat，SAHA），貝利司他（belinostat，PXD101）和帕比司他（panobinostat，LBH589），據(jù)報道它們是影響Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ類HDACs 的非特異性抑制劑。然而，進一步關于SAHA 的測試[16]表明，它只能在合理濃度下抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3 和HDAC6。其中曲古霉素A（trichostatin a，TSA）是第1 種被證實可廣譜抑制HDACs 的天然異羥肟酸抑制劑[17]。第4 種FDA 批準的HDACi 是環(huán)肽類的羅米地辛（romidepsin，F(xiàn)K228），據(jù)報道對Ⅰ類HDACs 有特異性。此外，LMK-235 原本被認為是Ⅱa 類（HDAC4，HDAC5）選擇性抑制劑，但進一步研究[18-19]揭示其有類似SAHA 的抑制特性，因此重新評估表明，LMK-235對Ⅰ類和Ⅱb 類也具有選擇性抑制作用?；诒郊柞０返腍DACi 是第一種選擇性靶向Ⅰ類HDACs 抑制劑，例如恩替諾 特 (entinostat，MS-275）可完全抑制HDAC1，HDAC2 和HDAC3。短鏈脂肪酸類抑制劑丙戊酸(valproic acid，VPA)在高濃度下對于Ⅰ類HDACs 有適度選擇性抑制作用。近期報道了一種新的HDACi 家族，酰肼類[20-21]。酰肼類的HDACi 是對HDAC1，HDAC2 和HDAC3 有效的選擇性抑制劑，且低濃度下就能發(fā)揮抑制作用。

4 抑制或基因敲除HDACs 與視神經(jīng)保護

4.1 視神經(jīng)擠壓術損傷模型

病理性眼壓升高引起視神經(jīng)頭周圍的壓力增加[22-23]，RGCs軸突在此處進入視神經(jīng)時會被壓迫造成局部損傷[24]。在大多數(shù)視神經(jīng)病變?nèi)缜喙庋鄣念A測病理生理學中，認為軸源性神經(jīng)變性先于體源性神經(jīng)變性。視神經(jīng)擠壓（optic nerve crush，ONC）通過誘導部分RGCs 軸突損傷來模擬這種分子事件，是一種廣泛認可的急性RGCs 損傷模型，已被用于研究RGCs死亡的內(nèi)在和外在凋亡機制[25-26]。孫頌美等[27]評估了玻璃體內(nèi)注射組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA 負載脂質(zhì)體（TSA 摻入聚乙二醇化脂質(zhì)體中）在ONC 小鼠模型中的神經(jīng)保護作用，發(fā)現(xiàn)注射后脂質(zhì)體到達了視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)，能顯著降低反應性膠質(zhì)增多癥和RGCs 凋亡，并增加了RGCs 的存活率。Schmitt 等[28]對C57BL/6 小鼠行ONC 后立即玻璃體腔內(nèi)注射RGFP966 來選擇性抑制HDAC3，分別于5、7、14 d 分析視網(wǎng)膜核萎縮和細胞丟失的程度，發(fā)現(xiàn)單次注射會立即引起對核萎縮的保護作用，類似于HDAC3 條件性敲除，且RGFP966 低濃度使用時，可防止細胞凋亡相關的組蛋白去乙?；?，減輕急性視神經(jīng)損傷后RGCs 的丟失，但在RGFP966 濃度增高后對阻止RGCs 長期丟失的作用也隨之減弱。Schmitt 和Pelzel 等[29]通過2 型腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠的RGCs，實現(xiàn)對RGCs 中HDAC3 的特異性敲除，之后建立ONC 模型，實驗證明RGCs 中HDAC3的敲除可顯著改善ONC 誘導的核萎縮的特征，減少RGCs 的死亡，但HDAC3 的敲除并沒有影響RGCs 特異性基因沉默的發(fā)生。Chindasub 等[30]使用HDAC1/3 選擇性抑制劑MS-275對小鼠皮下注射3 次/周，從ONC 前1 周開始，持續(xù)6 周。經(jīng)視網(wǎng)膜熒光神經(jīng)元平均存活率和病理組織學的統(tǒng)計分析結果證實，MS-275 治療可預防視神經(jīng)損傷后RGCs 分化功能的喪失，促進RGCs 存活。Zhang 等[31]在ONC 前1 d 對大鼠皮下注射VPA 和丁酸鈉（sodium butyrate，SB；一種廣譜HDACi），14 d 后處死。結果顯示，VPA 和SB 改善了視網(wǎng)膜電圖a 波和b波振幅的降低水平；減弱了RGCs 中胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的激活，并伴有視網(wǎng)膜蘇氨酸激酶（threonine kinase，AKT）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）磷酸化的上調(diào)，認為VPA 可能通過激活BDNF-TRKB 信號通路和抑制HDACs 來阻礙RGCs 凋亡。Pelzel 等[26]先前的研究發(fā)現(xiàn)用TSA 抑制視網(wǎng)膜中HDACs 的活性能夠維持ONC 后RGCs 特異性基因的表達，特別是HDAC3 可能在凋亡基因沉默中具有重要意義；且TSA 能抑制RGCs 的凋亡。Biermann 等[32]對大鼠左眼行ONC 后，皮下連續(xù)注射VPA 或Ringer 溶液。ONC 后5d 和8d，與Ringer 溶液（62%和37%RGCs 存活）相比，皮下VPA 處理后93%和58%RGCs 存活。證明VPA 可介導ONC 后RGCs 的神經(jīng)保護作用。

4.2 興奮性毒性誘導損傷模型

興奮性毒性是一種病理現(xiàn)象，視神經(jīng)損傷后，損傷的RGCs 和鄰近細胞釋放谷氨酸，通過與谷氨酸受體結合，促進細胞外Ca2+內(nèi)流導致神經(jīng)元死亡[33]。N-甲基-天冬氨酸（Nmethyl-D-aspartate，NMDA）受體是高度谷氨酸水平或NMDA暴露引起的興奮性毒性細胞死亡的主要啟動子[34]。NMDA 受體介導的興奮性毒性與多種神經(jīng)病理學相關[35]。在眼病中，興奮性毒性與青光眼、視網(wǎng)膜缺血和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制均相關[36-37]。Annabelle 等[34]對成年小鼠玻璃體腔內(nèi)注射NMDA 建立RGCs 變性模型，在損傷后1、7 d 檢測到RGCs 為時間依賴性丟失，在使用MS-275 和LMK-235 分別選擇性抑制HDAC1/3 和HDAC4/5 后，發(fā)現(xiàn)可以阻礙正在進行的RGCs 變性，并將HDAC1/3 和HDAC4/5 鑒定為治療退行性視網(wǎng)膜疾病的潛在治療靶點。

4.3 與眼壓相關損傷模型

在臨床中，導致青光眼視野喪失、視盤突出以及RGCs 變性等病理損害的主要危險因素是眼壓升高。故而模擬符合臨床眼壓特征的慢性高眼壓/正常眼壓性青光眼動物模型是必要的。谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運體基因缺失（glutamate/aspartate transporter gene deletion，GLAST-KO）小鼠已被用作構建正常眼壓性青光眼（normal tension glaucoma，NTG）小鼠模型，其模型特點為在眼壓不升高的情況下發(fā)生進行性RGCs 丟失和視神經(jīng)變性，并表現(xiàn)出包括谷氨酸神經(jīng)毒性和視網(wǎng)膜氧化應激在內(nèi)的青光眼病理學特征。Kimura 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，VPA 治療可阻礙GLAST-KO 小鼠RGCs 的死亡和視網(wǎng)膜內(nèi)層變薄，減少視網(wǎng)膜的氧化應激，并刺激與ERK 相關的細胞存活信號通路的激活。Alsarraf 等[39]用高滲鹽水注射大鼠單側(cè)眼構建高眼壓視神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)1 周內(nèi)HDACs 活性顯著升高，2周內(nèi)組蛋白H3 乙?；@著降低。經(jīng)VPA 治療4 周后圖形視網(wǎng)膜電圖振幅始終維持良好水平，RGCs 密度也保持顯著，與對照組無顯著差異。基于實驗結果認為HDACs 活性升高是眼壓升高引起的早期視網(wǎng)膜事件，抑制HDACs 活性可以保護RGCs 免受眼壓應激損害。Zaidi 等[40]同樣用高滲鹽水構建大鼠青光眼高眼壓模型，發(fā)現(xiàn)Ⅰ類和Ⅱb 類HDACs 活性在第7 d 和第42 d 的視網(wǎng)膜組織中顯著增加，且HDACs 的mRNA和蛋白質(zhì)表達在第42 d 進一步增強。高眼壓動物的視力、對比敏感度和模式視網(wǎng)膜電圖顯著下降。通過δ-阿片受體激動劑（δ-Opioid receptor agonist，SNC-121）早期干預后，Ⅰ類和Ⅱb 類HDACs 活性得到有效抑制，各項指標與模型組比較均顯著改善。

4.4 其他視神經(jīng)損傷模型

Lebrun-Julien 等[41]建立了以RGCs 為靶點的條件敲除HDAC1/2 小鼠，研究HDAC1/2 在軸突切開視神經(jīng)損傷模型中的作用。發(fā)現(xiàn)p53-PUMA 凋亡誘導通路在軸突切開的RGCs 中被強烈激活，特異性HDAC1/2 敲除可損害p53（腫瘤抑制因子）乙?；癄顟B(tài)和減少PUMA（p53 上調(diào)凋亡調(diào)控因子）的表達從而抑制這一凋亡途徑的激活，維持RGCs 的存活。Yoshiki 等[42]用鑷子在成年大鼠眼后2 mm 處壓碎視神經(jīng)10 s 建立損傷模型，經(jīng)TSA 處理后損傷的RGCs 軸突再生。在視網(wǎng)膜外植體中也發(fā)現(xiàn)，VPA 能刺激神經(jīng)軸突向外生長[43]。表明HDACi 不僅具有神經(jīng)保護作用，還能增加受損神經(jīng)元的再生潛能。此外，RGCs 的純化培養(yǎng)物也受益于HDACi（VPA，TSA 和SB）的處理，可減少RGCs 凋亡[44]。在慢性年齡相關性青光眼DBA/2J 小鼠模型中也被證明HDACi 可有效減輕RGCs 特異性Fem1cR3 基因表達的降低[45]，但靶向消融HDAC3 的活性不能保護RGCs 免受軸突變性或體細胞死亡，使用RGFP966 抑制HDAC3 活性可對老年DBA/2J 小鼠神經(jīng)節(jié)細胞層的體細胞丟失提供輕度保護作用[46]。

5 小結

目前對青光眼的治療仍是藥物和/或抗青光眼手術療法以維持眼壓的正常和穩(wěn)定，所以尋找針對受影響組織的輔助治療方法是備受關注的。迄今為止，HDACi 對視神經(jīng)損傷動物模型的研究已顯示出治療青光眼等視網(wǎng)膜退行性疾病的巨大前景?？紤]到青光眼RGCs 死亡是隨著時間亦步亦趨的，需要在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)持續(xù)治療，以維持患者視功能。然而這些抑制劑，特別是廣譜抑制劑，在高劑量給藥時對快速分裂的細胞有毒副作用[47]。所以通過對RGCs 的凋亡機制和各種視神經(jīng)損傷模型的研究來深入挖掘抑制HDACs 調(diào)控神經(jīng)元存活的各種途徑，以及進一步探討受損RGCs 中每個HDACs的確切生物學機制，以確定哪些HDACs 可作為青光眼等視網(wǎng)膜退行性疾病HDACs 抑制療法的合適靶點，是未來的研究方向。