基于網(wǎng)絡藥理學探討啟明丸控制近視進展的作用機制

蔣飄，宿蕾艷，莊曾淵，楊永升，張莎莎，夏秋芳，亢澤峰，臧玉玲

近視是眼在調(diào)節(jié)放松的狀態(tài)下，平行光線經(jīng)屈光系統(tǒng)折射后，焦點落在視網(wǎng)膜之前的一種屈光狀態(tài)[1]。目前近視患病率逐年攀升，已成為世界上視力受損的主要原因[2]，預計到2050 年，全球近視患病率將上升至49.8%，其中9.8%為高度近視[3]。我國作為近視大國，近視人群達7 億[4]，青少年近視患病率穩(wěn)居全球最高[5]，青少年視覺健康狀況下降在影響其學習、生活與擇業(yè)的同時，也影響到了我國的國際競爭力。因此，我國在2018 年就將青少年近視防控上升為國家戰(zhàn)略[6]。

本病在中醫(yī)亦稱為近視，中醫(yī)認為五臟六腑之精氣皆上注于目，眼病的發(fā)生與五臟六腑都相關。當前近視多發(fā)主要是用眼過度，以致心陽溫煦不及，目竅不通，神光不得發(fā)越于遠處，從而導致近視的出現(xiàn)。明代龔廷賢[7]認為：“目能近視，而不能遠視，有水而無火也。法當補心，定志丸加茯苓主之”。在《一草亭目科全書》[8]中亦載有“定志丸，治目能近視不能遠視”。啟明丸是莊曾淵研究員在定志丸的基礎上，結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗以及當前近視發(fā)病的特點，加郁金、丹參以化瘀行氣，加黃精、山藥以補虛養(yǎng)神，諸藥合用，共奏補益心脾，益氣養(yǎng)血，開竅明目的功效，主要用于控制青少年近視的進展。啟明丸作為院內(nèi)制劑，在本院臨床應用已有20 余年，費永彪[9]的研究明確了啟明丸對豚鼠近視進展干預的有效性。本文旨在基于網(wǎng)絡藥理學、生物信息學進一步探討啟明丸控制近視進展的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 啟明丸有效成分的篩選和靶點預測

運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology data-base and analysis platform，TCMSP）、（Traditional Chinese Medicine integrative database for herb molecular mechanism analysis，TCMID）收集啟明丸中人參、茯苓、山藥、遠志、石菖蒲、丹參、郁金、黃精的化學成分，根據(jù)藥代動力學參數(shù)篩選有效成分后，下載其mol2 結(jié)構式，經(jīng)過open babel 2.4.1 轉(zhuǎn)化并保存各化合物SMILES 結(jié)構式，利用SwissTargetPrediction進行藥物的靶點預測。

1.2 近視疾病靶點收集

以“myopia”作為關鍵詞，通過已知疾病靶點數(shù)據(jù)庫對其作用靶點進行查詢。查詢的已知疾病數(shù)據(jù)庫有Genecards、TTD、Drugbank、DisGeNET、OMIM、PharmGKB。刪除重復靶點，得到已知近視的作用靶點。

1.3 啟明丸有效成分與潛在靶點網(wǎng)絡構建

為找出啟明丸控制近視進展的有效成分及作用靶點，可通過Venny2.1.0 得到啟明丸的化學成分靶點與近視靶點的交集，將篩選出的靶點和對應的有效成分導入Cytoscape3.7.1 軟件中構建網(wǎng)絡圖。

1.4 PPI 網(wǎng)絡的構建及核心靶點的篩選

根據(jù)上一步驟得到的啟明丸的化學成分靶點與近視靶點的交集，利用STRING 數(shù)據(jù)庫，構建蛋白互作網(wǎng)絡（PPI scores＞0.4）。將篩選后的靶點導入到Cytoscape3.7.1 軟件中進行可視化分析，利用自由度（Degree）、介度（Betweenness）、緊密度（Closeness）3個拓撲參數(shù)（在網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵作用）進行篩選，以同時不低于這3 個值的中位數(shù)作為篩選條件，進一步篩選核心靶點，構建藥物靶點-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡。

1.5 GO 功能富集分析

將獲取到的核心靶點使用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析，解析啟明丸的潛在作用機制。

2 結(jié)果

2.1 啟明丸化學成分靶點分析結(jié)果

經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索并以OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選條件，收集到啟明丸中各中藥有效成分為人參22 種、茯苓15 種、山藥16 種、黃精12 種、郁金15 種、丹參65 種、石菖蒲4 種；基于TCMID 數(shù)據(jù)庫共收集到遠志79 種成分。

利用SwissTargetPrediction 對上述化學成分進行靶點預測，根據(jù)Probability≥0.15 篩選靶點，刪除重復值后，共得到啟明丸作用靶點197 個。

2.2 近視相關作用靶點分析結(jié)果

近視作用靶點的檢測可以通過檢索疾病相關靶點數(shù)據(jù)庫進行收集。Genecards、TTD、Drugbank、DisGeNET、OMIM、PharmGKB 是國際上公認的疾病靶點檢測數(shù)據(jù)庫，本文通過分別檢索以上數(shù)據(jù)庫得到近視相關作用靶點，分別檢索到4559、2、1、333、47、11 個靶點。刪去重復靶點，得到4586 個近視相關作用靶點。

2.3 啟明丸控制近視進展的有效成分

將啟明丸化學成分靶點與近視的疾病靶點共同導入到Venny2.1.0 中，獲取兩者的交集共有80 個靶點（圖1）。根據(jù)這80 個靶點共找出啟明丸控制近視進展的化學成分47 個，利用Cytoscape3.7.1 軟件中構建啟明丸有效成分-靶點網(wǎng)絡圖（圖2）。通過分析網(wǎng)絡，藥物成分中MOL000422（山奈酚）自由度為99，介度為0.26180257，緊密度為0.4751773，預測山奈酚為啟明丸控制近視進展的主要成分；其次為MOL000006（木犀草素）（自由度為49，介度為0.25839337，緊密度為0.4751773）、MOL006331（4′,5二羥基黃酮）（自由度為30，介度為0.09095026，緊密度為0.39181287）、MOL002714（黃芩素）（自由度為24，介度為0.08271159，緊密度為0.38953488），其中山奈酚為人參、石菖蒲共有成分，木犀草素為丹參的成分，4′,5 二羥基黃酮、黃芩素為黃精的成分，揭示了中藥復方多成分協(xié)同作用的特點。

圖1 啟明丸與近視交集靶點

圖2 啟明丸有效成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡的構建及核心靶點的篩選

將上述交集的80 個靶點導入到STRING 數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)相互作用分析（PPI），根據(jù)蛋白質(zhì)相互作用得分（PPI score＞0.4），初步篩選關鍵靶點蛋白，然后導入Cytoscape3.7.1 中進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡構建，通過Network Analyzer 插件對網(wǎng)絡的拓撲性質(zhì)進行分析。同時取Degree，Betweenness centrality，Closeness3 個拓撲參數(shù)的中位數(shù)為閾值（分別為7，0.0031，0.4405），最終獲得27 個相互作用的核心靶點，分別為AKT1、EGFR、SRC、STAT3、ESR1、APP、KDR、AR、PIK3R1、MMP9、PPARG、MMP2、EZH2、ABCB1、GSK3B、KIT、NTRK2、IGF1R、TERT、PTPN11、CYP19A1、CDK5、AHR、BACE1、AKR1B1、DRD4、ACHE（圖3、4）。

圖3 啟明丸靶點與近視靶點的相互關系圖

圖4 核心靶點的蛋白互作圖

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在線平臺對PPI 網(wǎng)絡中的關鍵靶點進行GO 功能富集分析，共確定了220 個GO 條目，每類選取富集程度排序最高的前20 條。結(jié)果顯示，在生物過程中，這些基因主要涉及在蛋白質(zhì)磷酸化、炎癥反應、DNA 復制、細胞增殖、細胞凋亡過程等方面（圖5）。在分子功能中主要涉及受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、激酶活性等（圖6）。在細胞成分中主要涉及質(zhì)膜、細胞質(zhì)、內(nèi)體、突觸后膜、受體復合物、核染色質(zhì)、高爾基體等（圖7）。

圖5 關鍵靶點的GO 富集-生物過程

圖6 關鍵靶點的GO 富集-分子功能

圖7 關鍵靶點的GO 富集-細胞組分

對核心靶點進行KEGG 通路富集分析，共確定了作用通路76 條，篩選前20 條進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與這些靶點關聯(lián)密切的通路有，雌激素信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor,HIF-1）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositide 3kinases-proteinkinaseB，PI3K-Akt）信號通路、Rap1信號通路、Ras 信號通路、ErbB 信號通路、FoxO 信號通路、如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路等（圖8）。

圖8 關鍵靶點的KEGG 富集通路分析

3 討論

近年來近視的發(fā)病率逐年上升，近視防控方法也越來越多樣化，中藥及其復方在影響近視發(fā)病的作用及機制受到廣泛關注。啟明丸已臨床應用20 余年，在控制近視進展方面取得較好成效。本研究共篩選出啟明丸與近視相關的作用靶點80 個。通過蛋白互作關系分析得到了MMP2、MMP9、STAT3、IGF1R、EGFR 等27 個靶點，這些即可能是啟明丸控制近視進展的關鍵靶點。

基因金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一種Ca2+、Zn2+依賴型酶家族，幾乎能降解細胞外基質(zhì)（ECM）中的各種蛋白成分。研究[10]表明，基因金屬蛋白酶2（MMP2）和基因金屬蛋白酶9（MMP9）主要降解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原及彈性蛋白，而鞏膜組織主要由Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原組成，因此，當MMP2、MMP9 表達增加可能會導致鞏膜膠原降解增加，眼球的抗張力下降，進一步可使得眼軸變長。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（Jak/Stat）信號轉(zhuǎn)導途徑中起著關鍵作用，晶狀體、脈絡膜、視網(wǎng)膜組織中均有這一家族成員的分布[11-12]。近視信使如生長素、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、視黃酸等與視網(wǎng)膜色素上皮或脈絡膜等細胞結(jié)合后能激活或抑制這些細胞STAT3 蛋白的活化與表達，通過STAT3 信號轉(zhuǎn)導通路,調(diào)節(jié)其下游的某些特定靶基因的表達，VEGF、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、MMP2 等作用于鞏膜,促進后極部鞏膜細胞的增生與分化及鞏膜細胞外基質(zhì)的重塑而產(chǎn)生近視[13]。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）是一類結(jié)構上與胰島素相似的多肽,主要作用于細胞生長、增殖、分化、成熟及再生等方面；IGF-1R 是IGF 系統(tǒng)的重要成員。研究[14]表明，IGF1 和IGF1R結(jié)合后,可能通過生長因子-受體信號級聯(lián)效應激活靜止態(tài)的G0/G1 期細胞向S 期轉(zhuǎn)變，使DNA 合成量增加，從而促進豚鼠鞏膜成纖維細胞的增殖。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)細胞等細胞表面，EGFR 信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR 與表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）結(jié)合后通過影響通路中相關因子的活性促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞和鞏膜細胞的增殖[15]。

為了進一步研究啟明丸控制近視進展的機制，了解核心基因在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了G0 生物學功能富集分析，發(fā)現(xiàn)影響的生物學過程主要集中在細胞增殖分化、細胞凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化、炎癥反應、DNA 復制、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合等方面。在靶點基因的KEGG 通路富集分析中，可以發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、HIF-1 信號通路富集程度較高，與近視關系密切。

其中，PI3K-Akt 信號通路是胰島素的重要下游通路，與細胞增殖和凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運有關。研究表明，胰島素有強大的促近視作用(主要是由于其對眼前段光學的影響)[16]，胰島素受體能激活PI3K-Akt信號通路[17]，PI3K 催化產(chǎn)生的產(chǎn)物能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activatorprotein 1,AP1）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等，參與調(diào)控鞏膜重塑等近視發(fā)生的多種生物過程[18]。

雌激素信號通路主要通過雌激素與雌激素受體（estrogen receptor,ER）結(jié)合而調(diào)節(jié)基因表達以發(fā)揮作用，新陳代謝、炎癥反應、心肌細胞存活等疾病過程受到雌激素和ER 結(jié)合后激活的細胞質(zhì)中的激酶或細胞核中的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[19]。研究[20]表明，視黃酸（retinoic acid,RA）能明顯抑制人鞏膜成纖維細胞的生長，雌激素能夠激活或者抑制AP1 依賴的轉(zhuǎn)錄，而AP1 和轉(zhuǎn)化生長因子-β2（transforming growth factor-β2,TGF-β2）能夠通過視黃酸信號通路調(diào)控豚鼠近視的形成[21-22]。此外，PI3K 信號通路可由雌激素和細胞膜上的ER 結(jié)合而激活[23]，進而通過影響鞏膜重塑而控制近視進展。

甲狀腺信號通路是甲狀腺功能的重要組成部分，甲狀腺激素（thyroid hormone,TH）可以通過調(diào)節(jié)發(fā)育中的視網(wǎng)膜中s 視蛋白和m 視蛋白的比率而影響視力。當TH 與甲狀腺激素受體β2（thyroid hormone receptor β2,TRβ2）結(jié)合后會抑制s 視蛋白并激活m 視蛋白[24]。在視網(wǎng)膜中TRβ2 僅限于視錐細胞感光細胞，研究表明TRβ2 是視錐細胞晚期分化的關鍵調(diào)節(jié)因子。此外，三碘甲腺原氨酸（3,5,3′-triiodothyronine,T3）可通過作用于視網(wǎng)膜前體細胞影響視錐細胞的分化，同時M 視蛋白及S 視蛋白的表達也受到T3 的影響[24-25]。以上結(jié)果顯示，甲狀腺激素能夠調(diào)控視錐細胞的分化和視蛋白的表達，從而影響近視進程。

HIF-1 是細胞內(nèi)對低氧敏感的因子之一，是由兩個基本的螺旋-環(huán)-螺旋PAS（Per-ARNT-Sim）蛋白缺氧誘導因子1-α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）和缺氧誘導因子1-β（hypoxia inducible factor-1β，HIF-1β）組成的異二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 可通過肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化促進近視的發(fā)生[26]，HIF-1α 在介導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用，導致鞏膜重塑從而影響近視發(fā)展。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法探討啟明丸控制近視進展的主要機制，發(fā)現(xiàn)啟明丸作用于MMP2、MMP9、STAT3、IGF1R、EGFR 等關鍵靶點，通過PI3K-Akt 信號通路、雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、HIF-1 信號通路等重要通路，影響鞏膜重塑、視錐細胞分化和視蛋白合成等過程發(fā)揮控制近視進展的作用。由于數(shù)據(jù)庫不完善、檢索不全面、分析不透徹等主客觀因素，使得本研究存在一定的局限性，仍需要進一步的深入研究。