植物乳桿菌和纖維素酶對玉米秸稈降解及糖化效果的影響

劉夢潔， 尹清強(qiáng)， 常 娟， 劉超齊， 王 平*， 黨曉偉， 盧富山

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；3.河南普愛飼料股份有限公司，河南周口 466000）

我國作為世界排名前列的農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈資源豐富，其中玉米秸稈作為主要農(nóng)作物秸稈之一，年產(chǎn)量約達(dá)2.3億t（石祖梁等，2019）。由于玉米秸稈的不合理利用，導(dǎo)致大部分秸稈資源被焚燒或棄置于農(nóng)田，造成了環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此玉米秸稈飼料資源的開發(fā)對秸稈資源的循環(huán)利用和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人畜爭糧、飼料原料短缺問題將會(huì)成為畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)制約因素（黃斌，2010）。因此，開發(fā)飼料資源，充分利用農(nóng)作物秸稈，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)，將是畜牧飼料資源開發(fā)的重點(diǎn)。

玉米秸稈中富含木質(zhì)纖維素，并且75%成分是由多糖組成，可將玉米秸稈轉(zhuǎn)化為能量原料。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在自然界中穩(wěn)定存在，很難被降解（桑羽希等，2019）。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素獨(dú)特的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)阻礙著纖維素酶與纖維素的接觸，而纖維素的結(jié)晶度也會(huì)影響著纖維素酶的酶解（Sun 等，2002；Caitriona等，1998）。 為使玉米秸稈得到充分利用，進(jìn)一步提高玉米秸稈的糖化效率和適口性，本文研究植物乳桿菌、纖維素酶單獨(dú)和復(fù)合處理對普通玉米秸稈和堿處理玉米秸稈處理效果，通過測定不同處理玉米秸稈中纖維素、半纖維素、還原糖含量和pH，感官評定秸稈氣味和形態(tài)，確定最佳處理組合及發(fā)酵和酶解時(shí)間，為玉米秸稈飼料資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 普通玉米秸稈：試驗(yàn)所用玉米秸稈取自河南省原陽縣郊區(qū)，挑選干凈的玉米秸稈去根，自然風(fēng)干，經(jīng)錘片式粉碎機(jī)粉碎，室溫保存。堿處理玉米秸稈：玉米秸稈經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后（80%過16目篩），按照液固比13:1加入水，1000 W、80℃超聲波處理30 min；再加入6%（m/m）CaO、2%（m/m）NaOH，84℃水浴處理6 h；降溫至室溫加入3%（V/V）雙氧水，處理4 h，風(fēng)干，65℃烘箱烘干后粉碎備用。植物乳桿菌：試驗(yàn)所用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，活菌數(shù)調(diào)整為1.0×109cfu/mL。纖維素酶：纖維素酶購于山東澤生生物科技有限公司，纖維素酶活活力為32.5 FPU/g。礦物元素營養(yǎng)液：制備礦物元素營養(yǎng)液的成分如表1所示。

表1 礦物元素營養(yǎng)液成分g/L

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 植物乳桿菌和纖維素酶單獨(dú)和復(fù)合處理玉米秸稈 試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，分為8個(gè)組，分別為普通玉米秸稈組，堿處理玉米秸稈組，普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌組，堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌組，普通玉米秸稈+5%纖維素酶組，堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶組，普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組，堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱取10.00 g玉米秸稈按固液比1:4（其中3、4、7、8組按固液比1:1.5添加營養(yǎng)液）于聚乙烯包裝袋中，121℃、20 min高壓滅菌，冷卻至室溫。用真空包裝機(jī)封口，置于40℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵和酶解7 d。發(fā)酵和酶解結(jié)束后，取濕樣進(jìn)行感官評定（氣味、顏色、質(zhì)地），測定pH，剩余樣品自然風(fēng)干。

1.2.2 最佳酶解和發(fā)酵時(shí)間 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇還原糖含量高的組合堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶探究最佳發(fā)酵和酶解時(shí)間。酶解和發(fā)酵條件同上，每組21個(gè)重復(fù)，每天取3個(gè)重復(fù)，共發(fā)酵和酶解7 d。酶解結(jié)束后，取濕樣測定pH，剩余樣品自然風(fēng)干，粉碎。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 pH測定 稱取0.5 g發(fā)酵后濕玉米秸稈于10 mL離心管中，加入4.5 mL蒸餾水，振蕩均勻后，用電子酸度計(jì)測定pH。

1.3.2 纖維素、半纖維素測定 采用濾袋法測定中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量 （Van Soest等，1991）。纖維素和半纖維素計(jì)算方法：纖維素=ADF-ADL-灰分；半纖維素=NDF-ADF。

1.3.3 還原糖測定 取處理后玉米秸稈0.5 g加入10 mL蒸餾水，放于30℃、200 r/min搖床中12 h后，取上清液測定還原糖，采用DNS法（孫偉偉等，2006）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵和酶解對玉米秸稈中纖維素、半纖維素、還原糖和pH的影響 由表2可知，堿處理玉米秸稈中纖維素含量顯著高于普通玉米秸稈（P<0.05），半纖維素和還原糖顯著低于普通玉米秸稈（P<0.05）。與普通玉米秸稈相比，普通玉米秸稈+5%纖維素酶和普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組玉米秸稈中纖維素降解率分別為23.56%和14.67%（P<0.05），半纖維素降解率分別降低5.97%和6.16%（P>0.05），還原糖含量分別提高1.32倍和0.47倍（P<0.05）；普通玉米秸稈+植物乳桿菌組玉米秸稈中纖維素、半纖維素和還原糖含量無顯著變化（P>0.05）。與堿處理玉米秸稈相比，堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶、堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組玉米秸稈中纖維素降解率分別降低66.61%和53.11%（P<0.05），半纖維素降解率分別降低 52.69%和55.47%（P<0.05），還原糖分別提高43.78倍和29.83倍（P<0.05），堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌組玉米秸稈中纖維素和半纖維素降解率分別降低10.53%和4.5%，還原糖提高0.44倍。這表明纖維素酶酶解和纖維素酶+植物乳桿菌共同發(fā)酵和酶解的效果要優(yōu)于單獨(dú)植物乳酸菌發(fā)酵，堿處理玉米秸稈處理效果優(yōu)于普通玉米秸稈。

表2 不同發(fā)酵和酶解對玉米秸稈纖維素、半纖維素、還原糖和pH的影響

與普通玉米秸稈組和堿處理玉米秸稈組相比，玉米秸稈經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵、纖維素酶酶解和植物乳桿菌+纖維素酶共同發(fā)酵和酶解，各組的pH 顯著降低（P<0.05）。

2.2 發(fā)酵和酶解對玉米秸稈顏色、形態(tài)及氣味的影響 普通玉米秸稈、普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌、普通玉米秸稈+5%纖維素酶和普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組處理7 d后顏色未發(fā)生變化，均為褐色，且玉米秸稈形態(tài)未發(fā)生變化，無水浸出。堿處理玉米秸稈、堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌、堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶處理7 d后顏色未發(fā)生變化，均為黃色，其中堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組玉米秸稈由固態(tài)變成水樣。普通玉米秸稈、堿處理玉米秸稈、普通玉米秸稈+5%纖維素酶、堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌組氣味未發(fā)生變化，是原玉米秸稈的味道；普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌組有輕微的酸味；普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組酸香味較濃。這表明用植物乳桿菌和纖維素酶復(fù)合發(fā)酵酶解玉米秸稈后具有較好風(fēng)味。

2.3 不同發(fā)酵和酶解時(shí)間對纖維素、半纖維素、還原糖和pH的影響 由圖1（A）可知，隨著發(fā)酵和酶解時(shí)間延長，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組纖維素含量逐漸降低，在第4天達(dá)到最低并趨于穩(wěn)定，為20.13%；堿處理秸稈+5%纖維素酶組纖維素含量在第5天趨于穩(wěn)定，為15.18%。在發(fā)酵和酶解過程中，堿處理秸稈+5%纖維素酶組纖維素降解率顯著低于堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組（P<0.05）。 由圖 1（B）可知，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組半纖維素在第5天達(dá)到最低（P<0.05）；堿處理秸稈+5%纖維素酶組半纖維素含量在第6天達(dá)到最低 （P<0.05）。除第1天堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組半纖維素含量顯著高于堿處理秸稈+5%纖維素酶組（P<0.05）外，在發(fā)酵和酶解的第2～5天，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組半纖維素含量均顯著低于堿處理秸稈+5%纖維素酶組（P<0.05），而在第6～7天，兩組半纖維素含量趨于穩(wěn)定，且差異不顯著（P>0.05）。 由圖 1（C）可知，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組還原糖含量在第4天達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定，為187.25 mg/g；堿處理秸稈+5%纖維素酶組還原糖含量逐漸提高，在第5天達(dá)到最高，為292.86 mg/g。除第1天外，堿處理秸稈+5%纖維素酶組還原糖含量顯著高于堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組（P<0.05）。 由圖 1（D）可知，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組pH在第5天達(dá)到最低并趨于穩(wěn)定（P<0.05）；堿處理秸稈+5%纖維素酶組pH逐漸降低，在第3天達(dá)到最低趨于穩(wěn)定 （P<0.05）。在發(fā)酵和酶解的第1天和3天，堿處理秸稈+5%纖維素酶組pH顯著低于堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組（P<0.05），而在第5天，堿處理秸稈+5%纖維素酶組pH顯著高于堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組 （P<0.05），第6～7天，兩組pH均趨于穩(wěn)定并且差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 發(fā)酵和酶解玉米秸稈對纖維素、半纖維素、還原糖和pH的影響 胡華佳等（2010）發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同稀堿液可破壞稻草秸稈結(jié)構(gòu)，剝離木質(zhì)素，從而提高秸稈的糖化率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與普通玉米秸稈相比，玉米秸稈經(jīng)過超聲波和堿處理后，可有效降解半纖維素和木質(zhì)素，從而暴露出纖維素，提高纖維素含量，但由于在處理時(shí)加有堿液，故pH增高，不利于轉(zhuǎn)化為葡萄糖。纖維素酶的最適pH為4.0～7.0（李豪等，2019），在酶解時(shí)需要調(diào)到適宜的pH才能最大的發(fā)揮酶解功能。而乳酸菌發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸，可顯著降低玉米秸稈pH（王中華，2002）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示植物乳桿菌發(fā)酵玉米秸稈可以降低pH，但是單一植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵對纖維素和半纖維素降解效果不佳。本試驗(yàn)用纖維素酶發(fā)酵普通玉米秸稈和堿處理玉米秸稈，pH均顯著降低，為酶解提供適宜的條件。纖維素酶可改變植物細(xì)胞壁的通透性，將纖維素水解為還原糖，玉米秸稈中含有豐富的纖維素，尤其是堿處理玉米秸稈，增大纖維素酶與纖維素的接觸面積。本試驗(yàn)在兩種玉米秸稈中添加纖維素酶進(jìn)行酶解，均降解玉米秸稈中的纖維素和半纖維素，轉(zhuǎn)化為可被動(dòng)物消化吸收的還原糖，并且堿處理玉米秸稈效果最佳，與王興吉等（2019）研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，將植物乳桿菌和纖維素酶同時(shí)加入普通玉米秸稈和堿處理玉米秸稈中進(jìn)行發(fā)酵和酶解發(fā)現(xiàn)，堿處理玉米秸稈纖維素、半纖維素降解率和還原糖含量均高于普通玉米秸稈，但是效果低于單一添加纖維素酶，可能是因?yàn)槔w維素酶與植物乳桿菌同時(shí)發(fā)酵和酶解時(shí)，酶解纖維素產(chǎn)生的還原糖被植物乳桿菌發(fā)酵利用 （王目森，2015；張平等，2012），導(dǎo)致還原糖含量降低，而植物乳桿菌發(fā)酵主要消耗含糖類物質(zhì)，對木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響（萬江春等，2019）。

3.2 發(fā)酵和酶解對玉米秸稈顏色、形態(tài)及氣味的影響 堿處理玉米秸稈成黃色主要是堿性雙氧水氧化的效果，酶解和發(fā)酵不能改變玉米秸稈的顏色。堿處理玉米秸稈+5%纖維素酶組和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組的玉米秸稈由固態(tài)變成水樣，此結(jié)果與纖維素和半纖維素含量減少，還原糖含量增加有關(guān)，主要是因?yàn)槔w維素和半纖維素被分解成可以溶于水的小分子糖，支撐其固體形態(tài)的物質(zhì)減少，所以在發(fā)酵酶解過程中試樣會(huì)變得越來越稀。待酶解和發(fā)酵玉米秸稈烘干后其物理性狀由原來的體積膨大、容重小、系水性強(qiáng)的蓬松短桿狀物質(zhì)變成體積小、容重大、易溶于水的固體粉狀物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了其作為飼料的可行性。乳酸菌常用于玉米秸稈的青貯和和黃貯來提高秸稈的適口性（謝華德等，2019；張適等，2019）。普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌組有輕微的酸味，堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌組未產(chǎn)生酸味，主要因?yàn)槠胀ㄓ衩捉斩捄蛪A處理玉米秸稈中含糖量少，發(fā)酵基質(zhì)中也沒有添加其他的碳水化合物，不能滿足植物乳桿菌大量生長。普通玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶和堿處理玉米秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組酸香味較濃，主要是因?yàn)樵诶w維素酶的作用下纖維素和半纖維素分解的還原糖被植物乳桿菌利用來滿足其繁殖。

3.3 發(fā)酵和酶解的時(shí)間對纖維素、半纖維素、還原糖和pH的影響 植物乳桿菌+纖維素酶共同發(fā)酵和酶解堿處理玉米秸稈還原糖含量低于纖維素酶單獨(dú)酶解，但是其風(fēng)味優(yōu)于單獨(dú)酶解。單獨(dú)纖維素酶酶解秸稈還原糖含量高可以作為能量飼料開發(fā)；植物乳桿菌+纖維素酶共同發(fā)酵和酶解秸稈既含乳酸菌和乳酸又含還原糖、少量纖維，可以開發(fā)功能型飼料，故確定這兩組最佳處理時(shí)間。

玉米秸稈與纖維素酶酶解的時(shí)間是玉米秸稈纖維素與半纖維素降解、還原糖轉(zhuǎn)化量和pH的重要因素之一。酶解時(shí)間的增加，改變底物濃度和纖維素酶的濃度，影響纖維素的降解，進(jìn)而影響玉米秸稈還原糖的轉(zhuǎn)化和pH。張萬忠等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶解率隨著玉米秸稈酶解時(shí)間的增加而加快，12 h后酶解率增加緩慢。劉紀(jì)成等（2019）研究表明，隨著花生秸稈發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性不斷增大，但是當(dāng)達(dá)到第10天之后，呈下降趨勢。在本試驗(yàn)中，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組分別在發(fā)酵和酶解的第4天和5天 ，纖維素和半纖維素降解率達(dá)到最高，之后呈下降趨勢；堿處理秸稈+5%纖維素酶組在酶解的第3天和6天，纖維素和半纖維素降解率分別達(dá)到最高，之后下降，與前人趨勢一致。易錦瓊等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)初始階段，酶水解轉(zhuǎn)化率增加較快；36 h后，還原糖轉(zhuǎn)化率上升趨勢逐漸平緩。田慶文等（2017）研究表明，隨著酶解時(shí)間的延長，還原糖轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢且不斷增大；在反應(yīng)的初始階段，還原糖轉(zhuǎn)化率增加較快，72 h后還原糖轉(zhuǎn)化率上升趨勢逐漸平穩(wěn)。在本試驗(yàn)中，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組和堿處理秸稈+5%纖維素酶組分別在發(fā)酵和酶解的第4天和5天還原糖轉(zhuǎn)化量達(dá)到最高；在發(fā)酵和酶解的初始階段，還原糖轉(zhuǎn)化率增加較快，隨著酶解時(shí)間延長還原糖轉(zhuǎn)換率逐漸降低，可能是因?yàn)樵诜磻?yīng)初始階段，纖維素酶濃度較高，且與底物充分接觸，反應(yīng)速率增大，而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，玉米秸稈經(jīng)堿處理后暴露出的纖維素基本酶解完成，導(dǎo)致還原糖的轉(zhuǎn)化率降低。纖維素酶主要來自于微生物 （孫喆等，2014）。研究表明，pH在4.0～7.0時(shí)，纖維素酶的酶活最高，而在秸稈中添加纖維素酶后pH顯著降低（Gupta等，2020；李樂等，2019）。本試驗(yàn)中，堿處理秸稈+5%植物乳桿菌+5%纖維素酶組和堿處理秸稈+5%纖維素酶組的pH隨著發(fā)酵和酶解時(shí)間的延長逐漸降低至酸性，有利于纖維素酶與底物反應(yīng)，提高還原糖含量，進(jìn)而增加玉米秸稈飼料的營養(yǎng)價(jià)值和適口性。前人研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈經(jīng)菌-酶復(fù)合制劑青貯或黃貯一般需發(fā)酵30～45 d可改善秸稈營養(yǎng)品質(zhì)（毛建紅等，2018；曾輝等，2018）。本試驗(yàn)堿處理玉米秸稈在固液比4:1，酶解溫度40℃條件下經(jīng)纖維素酶酶解，還原糖含量在第5天時(shí)達(dá)到最高，為292.86 mg/g；堿處理秸稈經(jīng)5%植物乳桿菌+5%纖維素酶共同發(fā)酵和酶解5 d即可完成，縮短了發(fā)酵和酶解時(shí)間。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)得出，經(jīng)過堿處理后的玉米秸稈，纖維素和半纖維素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更有利于酶解；單一纖維素酶酶解玉米秸稈的還原糖含量高于單一植物乳桿菌發(fā)酵以及植物乳桿菌+纖維素酶共同發(fā)酵和酶解；植物乳桿菌+纖維素酶共同發(fā)酵和酶解堿處理玉米秸稈風(fēng)味優(yōu)于植物乳桿菌和纖維素酶單一發(fā)酵酶解堿處理秸稈。玉米秸稈經(jīng)過超聲波、堿和雙氧水處理后，纖維素酶單獨(dú)酶解5 d，秸稈中還原糖含量達(dá)到最高；植物乳桿菌+纖維素酶復(fù)合發(fā)酵和酶解5 d半纖維素含量和pH達(dá)到最低。堿處理秸稈經(jīng)纖維素酶單獨(dú)發(fā)酵和植物乳桿菌+纖維素酶復(fù)合發(fā)酵和酶解有利于提高玉米秸稈的消化利用率和適口性，可以開發(fā)成不同形式的飼料原料。