富銅微生物的篩選以及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

魯 陳， 刁 歡， 丁小玲， 代張超， 閆一博， 李呂木*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥 230081）

銅是動(dòng)物的必需微量元素。一系列的試驗(yàn)證明，飼喂高出需要量的高銅日糧，可促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，較為經(jīng)濟(jì)有效的飼喂量為110～250 mg/kg（Ma 等，2015；李永義等，2002；Hill等，2000）。 然而，目前高銅的來(lái)源主要是無(wú)機(jī)硫酸銅，因?yàn)槠鋬r(jià)格便宜。但是豬對(duì)其吸收率低，導(dǎo)致糞尿銅排泄多，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重（Huang等，2007）?；诖?，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2009年對(duì)飼糧中銅含量進(jìn)行了限量規(guī)定，限定銅的最高添加量斷奶仔豬為200 mg/kg，生長(zhǎng)肥育豬為150 mg/kg，盡量降低殘留和對(duì)環(huán)境的污染。與此同時(shí)，低殘留的有機(jī)銅飼料添加劑先后被開(kāi)發(fā)出來(lái)，如堿式氯化銅 （Guo等，2017）、氨基酸螯合銅 （Jarosz等，2017）、殼聚糖銅（Yue 等，2016）和酵母銅（Lim等，2006）等。但是這些有機(jī)銅源生產(chǎn)成本高（Feng等，2014）。因此，研發(fā)既高效又經(jīng)濟(jì)的飼用有機(jī)銅添加劑，對(duì)促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Fomchenko（2015）等研究發(fā)現(xiàn)，微生物能富集轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)銅為微生物有機(jī)銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，微生物有機(jī)銅如酵母銅，受到人們的青睞，但這類(lèi)高銅菌的篩選主要是利用傳統(tǒng)的飼用微生物作為資源進(jìn)行馴化，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間銅誘導(dǎo)培養(yǎng)來(lái)獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩(wěn)定性差，易退化，富銅能力也會(huì)隨之下降。為此，本研究擬從富銅土壤中篩選高銅菌株，以期獲得將無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物有機(jī)銅的高效菌株，為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供高效廉價(jià)的新型有機(jī)銅添加劑。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 火焰原子吸收光譜儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司，型號(hào)：ZEEnit700p）；恒溫?fù)u床（上海三發(fā)科技有限公司，型號(hào)：ZHP-250）；烘箱（合肥達(dá)斯卡特科學(xué)有限公司，型號(hào)：DGTG82A）；消化爐（上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)：ML-3-4）；pH計(jì) （上海盛磁儀器有限公司，型號(hào)：PHS-25）。

1.2 篩選材料和培養(yǎng)基 篩選材料：安徽省銅陵市一廢棄銅礦土壤。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水 1000 mL，pH 7.2 ～ 7.4；PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，水 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2；固體培養(yǎng)基：由上述的培養(yǎng)基加入2%的瓊脂制成。以上培養(yǎng)基均在121℃，滅菌30 min；含Cu2+培養(yǎng)基：將上述培養(yǎng)基滅菌后，加入無(wú)菌的硫酸銅溶液，分別配制濃度為 200、400、600、800 mg/L 和1000 mg/L的5種含Cu2+培養(yǎng)基。

1.3 菌株的分離和篩選

1.3.1 土樣的采集及處理 刮去表層土壤，采集5～10 cm處土樣約100 g于信封中保存?zhèn)溆谩Ｈ⊥寥?0 g，放入有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩均勻。然后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)来沃苽?0-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的土壤稀釋液。

1.3.2 富銅菌種的分離和篩選 在無(wú)菌條件下吸取0.1 mL相應(yīng)濃度土壤稀釋液，用涂布平板法涂布分別將細(xì)菌和真菌涂布在NB和PDA固體培養(yǎng)基上，NB固體培養(yǎng)基在37℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d；PDA固體培養(yǎng)基在30℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀(guān)察，挑取不同形態(tài)單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，編號(hào)并保存菌種。

將篩選出的菌株涂布到Cu2+濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，記錄耐受力高的菌株，并將耐受菌株再接種到Cu2+濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀(guān)察。按此方法，依次將耐受菌株接種到Cu2+濃度為600、800、1000 mg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)并觀(guān)察其生長(zhǎng)情況，逐步淘汰耐銅能力差的菌株，篩選出耐受力高的菌株。將耐受力高的菌株進(jìn)行富銅轉(zhuǎn)化率的復(fù)篩，最后選擇耐銅力高的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察并送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行26S rDNA鑒定并測(cè)序，使用 NCBI中的Blast軟件分析菌株測(cè)序結(jié)果。

1.4 胞內(nèi)銅含量的測(cè)定 稱(chēng)取0.3 g左右于60℃完全干燥至恒重的菌體于燒杯中，加入10 mL混合酸（硝酸：高氯酸 4:1），置于消化爐上，消化至透亮，冷卻。轉(zhuǎn)移溶液至50 mL容量瓶中，加去離子水定容，然后用火焰原子分光光度計(jì)測(cè)量銅離子含量（Jorhem 等，2000）。

1.5 培養(yǎng)條件對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響

1.5.1 銅濃度對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響將種子液按1%的接種量接種在濃度為2、4、6、8、10 mg/L的PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，30℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d，三層濾紙過(guò)濾收集菌體，用生理鹽水洗三次，菌體置于透析袋中用去離子水透析，直至透析袋外水中無(wú)銅離子。于60℃烘箱中烘至恒重，依方法1.4所示測(cè)定菌體的胞內(nèi)銅含量。

1.5.2 菌液接種量對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌液分別按接種量1%、3%、5%、7%、9%（V/V）接種，每組 3個(gè)平行，在30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，測(cè)定銅含量。

1.5.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌液按1%的接種量接種后，在 30 ℃，200 r/min 條件下，放置 2、3、4、5、6、7 d六種不同的培養(yǎng)時(shí)間搖瓶培養(yǎng)，每組3個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定銅含量。

1.5.4 培養(yǎng)溫度對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌株按1%的接種量接種后，分別在 26、28、30、32、34 ℃五種不同溫度下，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，每組3個(gè)平行，測(cè)定銅含量。

1.5.5 pH對(duì)無(wú)機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L，pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的 PDA 培養(yǎng)基，將菌株按1%的接種量接種后，每組3個(gè)平行試驗(yàn)，在30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d后，測(cè)定銅含量。

1.5.6 正交優(yōu)化培養(yǎng)條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用 L9（34）正交試驗(yàn)方法，對(duì)溫度（A）、pH（B）、接種量（C）、培養(yǎng)時(shí)間（D）4 因素 3 水平進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 轉(zhuǎn)化率測(cè)定 轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

轉(zhuǎn)化率/%=A/B×100；

式中：A為微生物胞內(nèi)含銅量，mg；B為培養(yǎng)基中添加的無(wú)機(jī)銅量，mg。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用 Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 20.0軟件對(duì)微生物銅轉(zhuǎn)化率進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，并以鄧肯新復(fù)極差法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行差異顯著性多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的鑒定 在高銅土壤中篩選得到31株菌株（表1），其中細(xì)菌18株，真菌13株。其中能耐受培養(yǎng)基銅濃度為200 mg/L的菌株有細(xì)菌15株，真菌10株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為400 mg/L的菌株有細(xì)菌13株，真菌8株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為600 mg/L的菌株有細(xì)菌5株，真菌6株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為800 mg/L的菌株有細(xì)菌2株，真菌5株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為1000 mg/L的只有真菌4株，細(xì)菌均不能耐受。在此4株真菌中，長(zhǎng)勢(shì)最好的兩株FT5和FT7經(jīng)鑒定分別為青霉菌和黑曲霉菌。由于前者為非飼用微生物，不再用于后續(xù)研究。

表1 不同菌株對(duì)Cu2+的耐受性

耐銅真菌FT7，形態(tài)學(xué)觀(guān)察菌株頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」?，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀，直徑2.5～4.0 μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800 μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一，頂囊球形，雙層小梗，分生孢子褐色球形。其基因序列已經(jīng)在Gen-Bank注冊(cè)，登陸號(hào)為MG712304。

將FT7的測(cè)序結(jié)果輸入GenBank，并用Blast軟件進(jìn)行同源性比較，挑選同源性高的菌株及同屬其他種的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1，與黑曲霉屬的多個(gè)菌株具有同源性，與黑曲霉（Aspergillus niger strain JX999490.1）同源性達(dá)到100%，說(shuō)明FT7為黑曲霉。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 由表2可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)基銅濃度逐漸增加，微生物富銅轉(zhuǎn)化率逐漸降低，培養(yǎng)基銅濃度為2 mg/L時(shí)，微生物銅得率最高，為83.53%，培養(yǎng)基銅剩余量為0.33 mg/L，低于0.5 mg/L，達(dá)到污水排放標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 8978-1996，1996），因此確定培養(yǎng)基銅的濃度為2 mg/L。

由表2可見(jiàn)，接種量會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)化率（P<0.05），隨著接種量的逐漸增大，富銅菌的富集轉(zhuǎn)化率逐漸增加，接種量達(dá)3%時(shí)，隨著接種量的增加，轉(zhuǎn)化率達(dá)到穩(wěn)定，最大轉(zhuǎn)化率為84.96%，說(shuō)明在菌種接種量為3%時(shí)，菌種數(shù)量和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量達(dá)到最適合的比例，有利于菌體吸收培養(yǎng)基中的銅元素；培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)化率（P<0.05），隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)5 d時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到一個(gè)峰值，轉(zhuǎn)化率為85.14%，隨后隨著時(shí)間的增加轉(zhuǎn)化率達(dá)到穩(wěn)定，該結(jié)果也說(shuō)明在菌體培養(yǎng)5 d后，菌體生長(zhǎng)增加變緩，生長(zhǎng)進(jìn)入或達(dá)到穩(wěn)定期，同時(shí)菌體對(duì)銅離子的富集達(dá)到最佳。

表2 培養(yǎng)基銅濃度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度和pH對(duì)微生物富銅轉(zhuǎn)化率的影響

溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率具有顯著影響（P<0.05），26～30℃，隨著培養(yǎng)溫度的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸增加，30℃時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，為85.42%，隨后隨著培養(yǎng)溫度增加，轉(zhuǎn)化率逐漸降低；培養(yǎng)基初始pH對(duì)富集轉(zhuǎn)化率也具有顯著影響（P<0.05），開(kāi)始隨著pH逐漸增加，轉(zhuǎn)化率逐漸增加，當(dāng)初始pH為5時(shí)轉(zhuǎn)化率最大，為84.94%，隨后隨著pH增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降。

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)轉(zhuǎn)化率影響最大的是pH，其次是溫度，最后是時(shí)間和接種量，即pH>溫度>時(shí)間>接種量。因此得到最優(yōu)組合為A1B2C3D3，即培養(yǎng)溫度29.5℃、pH 5、接種量4%和培養(yǎng)時(shí)間5.5 d。驗(yàn)證該條件下的轉(zhuǎn)化率為87.65%，高于正交試驗(yàn)中的所有組合，證明其確為最優(yōu)組合條件。

由表4可知，溫度、pH、接種量和時(shí)間都能極顯著影響轉(zhuǎn)化率（P<0.01），各水平之間差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 富銅菌的分離篩選與鑒定 一般在受重金屬污染的地區(qū)都可以篩選到抗重金屬的微生物，這些微生物都通過(guò)菌體表面電荷、離子泵、載體協(xié)助、脂類(lèi)過(guò)度氧化和復(fù)合物滲透等完成對(duì)金屬離子的吸附（Li等，2015；Xia 等，2013），并通過(guò)胞外吸附和胞內(nèi)螯合完成富集 （Anahid等，2011）。因此，本研究以高銅土壤為原料進(jìn)行富銅微生物篩選，最終篩得一株耐高銅真菌，耐銅量達(dá)到1000 mg/mL，說(shuō)明有針對(duì)性的采集樣本，可以提高篩選效率。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 Duncan’s多重比較

3.2 富銅微生物菌體的洗脫 目前對(duì)與洗脫活菌體的緩沖液報(bào)道較少，本試驗(yàn)以上清液中銅的濃度為指標(biāo)，采用先通過(guò)生理鹽水沖洗三遍，然后通過(guò)透析袋在去離子水中透析直到上清液中測(cè)不出銅離子，對(duì)富銅菌體進(jìn)行洗脫，以洗掉菌體表面吸附不牢固的無(wú)機(jī)銅，確保得到都是微生物銅。菌體在吸附金屬離子的過(guò)程中，金屬銅離子通過(guò)與細(xì)胞表面特別是與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等）中的化學(xué)基團(tuán)（如羧基、羥基、磷?；?、酰胺基、硫酸脂基、氨基、硫基等）的相互作用，吸附螯合到細(xì)胞表面（陳燦等，2006）。與同類(lèi)其他文章通過(guò)EDTA緩沖液洗脫菌體相比，EDTA緩沖液螯合能力強(qiáng)，會(huì)去除螯合細(xì)胞壁上的金屬銅。本試驗(yàn)采用的洗脫方法能更好地保留螯合在細(xì)胞表面的銅離子，可以獲得更多的有機(jī)銅。

3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化 菌液的接種量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響轉(zhuǎn)化率，本試驗(yàn)中，接種量過(guò)低（1%）時(shí)，銅轉(zhuǎn)化率低，接種量逐漸增加達(dá)到一定量 （3%）時(shí)，轉(zhuǎn)化率逐漸升高并達(dá)到穩(wěn)定。這可能是由于Cu2+的濃度一定時(shí)，菌體數(shù)量增加，活性吸附點(diǎn)增多，菌體表面與金屬離子接觸和結(jié)合的機(jī)會(huì)也增加，必然有更多的Cu2+被吸附，相應(yīng)地使Cu2+的吸附率增大；但超過(guò)一定范圍后，隨著菌體數(shù)量的增加，菌體細(xì)胞之間兩性基團(tuán)的相互結(jié)合作用不斷增加，占據(jù)了部分有效的結(jié)合位點(diǎn) （林海等，2013）。因而當(dāng)菌液接種量一定時(shí)，轉(zhuǎn)化率不會(huì)隨著菌液添加量的增大而增大（∨Sillerová等，2012）。

培養(yǎng)溫度不僅對(duì)微生物的生長(zhǎng)和新陳代謝有影響，而且影響微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性。因此，不同微生物富集轉(zhuǎn)化銅的溫度都不一樣，如假單胞菌USTB-E，在溫度為35℃時(shí)富集性能最好（王海鷗等，2011）。本試驗(yàn)獲得的黑曲霉FT7最佳富集轉(zhuǎn)化率溫度為29.5℃，說(shuō)明溫度過(guò)高可能導(dǎo)致菌株內(nèi)酶的活性降低甚至喪失，影響菌株的生長(zhǎng)代謝，造成菌株FT7轉(zhuǎn)化率低。溫度過(guò)低，菌株生長(zhǎng)緩慢并導(dǎo)致體內(nèi)酶活性降低，從而減少菌體內(nèi)代謝產(chǎn)物的生成和積累，降低微生物銅產(chǎn)生，減少積累量，降低轉(zhuǎn)化率。

pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響顯著，因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的大多數(shù)酶促反應(yīng)都需要一個(gè)適宜的pH范圍，只有在合適的pH范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)的速率才會(huì)達(dá)到最高，低于或者高于這個(gè)范圍，微生物的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。pH通過(guò)影響細(xì)胞質(zhì)膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、物質(zhì)的溶解性和表面電荷氧化還原電位來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響物生物的生長(zhǎng)速率（Liu等，2014；葉錦韶等，2011）。本試驗(yàn)初始pH為5時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大，為84.94%，隨后隨著pH的增加轉(zhuǎn)化率下降，pH低于5時(shí)，隨著pH的增加而轉(zhuǎn)化率增加，說(shuō)明該菌在堿性環(huán)境下轉(zhuǎn)化率較差，在弱酸性條件下有較高富銅轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié)論

從高銅土壤中篩選得到一株真菌FT7，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為黑曲霉。在銅濃度為2 mg/L的條件下，菌株FT7轉(zhuǎn)化銅的最佳培養(yǎng)條件為溫度29.5℃、pH 5、接種量4%和培養(yǎng)時(shí)間5.5 d，該條件下其轉(zhuǎn)化率可達(dá)87.65%。