液體活檢在肝癌中的研究進(jìn)展

陳 靜 任少平 吳志全

肝細(xì)胞肝癌（HCC）簡稱肝癌，是嚴(yán)重威脅我國人民群眾生命健康的惡性腫瘤，占我國惡性腫瘤死亡率的第2 位，我國是肝癌大國，肝癌發(fā)病率位列全世界第5 位，死亡原因位列第3 位[1]，它具有起病隱匿，手術(shù)切除率低，易早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。雖然經(jīng)過多年研究，診斷及治療水平有了很大提高，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍較高，因此，采取更加精準(zhǔn)、簡易、有效的方法，成為臨床工作中迫切需要解決的課題。近年來，隨著肝癌細(xì)胞研究的深入和生物學(xué)技術(shù)的提高，液體活檢技術(shù)成為肝癌研究的一個熱點(diǎn)。液體活檢是將人體體液（尿液、胸水、腹水等）或者血液中的某些微小的成分（腫瘤細(xì)胞，腫瘤核酸或外泌體）通過特殊的方法進(jìn)行濃縮、富集和鑒定，從而了解體液中具有腫瘤或基因特征的信息[2]。相對于組織活檢而言，液體活檢快速、安全、微創(chuàng)，因而患者依從性好，方便實(shí)時動態(tài)監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的變化，故而被認(rèn)為是組織活檢有效的補(bǔ)充[3]。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的生物學(xué)特性及檢測方法

1869 年，澳大利亞病理科醫(yī)生在乳腺癌死亡患者血中發(fā)現(xiàn)了與乳腺腫瘤形態(tài)相似的細(xì)胞，并命名為CTCs，但由于認(rèn)識及分離技術(shù)等多方面原因，未能引起足夠的重視[4]。CTCs 是腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血或術(shù)中擠壓腫瘤進(jìn)入外周血，HCC-CTCs直徑可達(dá)12～25μm，明顯大于多數(shù)血液細(xì)胞，且多保留有肝癌細(xì)胞特異表型，這種存在于外周血液中的腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的一個主要途徑。由于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血液后，絕大部分被免疫細(xì)胞消滅，只有極少數(shù)存活下來，每百萬血細(xì)胞中只有1～2 個，因此，在大量血細(xì)胞背景下富集和生物學(xué)鑒定是兩大具有挑戰(zhàn)的工作。富集極少量的CTCs 主要根據(jù)下列兩種方法：基于CTCs 的物理特性（大小、密度、形狀、電性等），或者生物學(xué)特性（細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，腫瘤特異RNA 或者循環(huán)游離脫氧核糖核酸等），目前，檢測肝癌患者CTCs 的方法較多，敏感性和特異性較強(qiáng)，檢測方法主要有免疫熒光標(biāo)記檢測，RNA原位雜交檢測和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測3 種[5]，國內(nèi)外使用較多的是Cellsearch 系統(tǒng)，它通過免疫磁性富集技術(shù)，準(zhǔn)確性較高。

1.1CTCs 檢測與肝癌的診斷問題 原發(fā)性肝癌的血清學(xué)診斷特異性方法只有甲胎蛋白（AFP）測定，但是仍有一定比例的假陽性和假陰性。在已經(jīng)確診的肝癌患者中，AFP 陰性者大約占30%，因此CTCs 檢測在某些方面可能優(yōu)于AFP。不同病期的肝癌患者，用不同方法檢測外周血的陽性率都在50%以上，如果采用敏感性更高的檢查方法，陽性率可達(dá)到80%以上[6-7]。舒葉菲和陳麗榮[5]應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD45、CD90 在肝癌患者血液中的分布情況，CTCs 檢出率高達(dá)90%，而在對照的肝硬化患者和健康人群中，均無CTCs 檢出，說明CTCs 在肝癌早期診斷中具有重要的意義。最新研究表明，肝癌臨床分級與血液中CTCs 的數(shù)量呈顯著正相關(guān)，因此，準(zhǔn)確檢出血液中CTCs 含量，直接影響患者臨床分級[8-9]。馬清等[10]在肝癌組（27 例）中CTCs 檢測陽性22 例（陽性率81.5%），而AFP 陽性17 例，癌胚抗原陽性10 例，糖類抗原19-9 陽性11 例，CTCs 診斷肝癌的約登指數(shù)均高于三項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測，且CTCs 聯(lián)合AFP 檢測可提高肝癌的早期診斷率。在早期原發(fā)性肝癌，即直徑＜3cm 的小肝癌診斷方面，影像學(xué)檢查（CT、MRI）已經(jīng)有了較高的診斷水平，但對不典型肝癌和直徑＜1cm 的極早期肝癌，也有診斷困難和誤診的時候，而CTCs 檢測有助于惡性腫瘤的鑒別診斷，假陽性率極低。利用生物學(xué)檢測方法檢出率較高，多種方法的聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高。近期，Kalinich 等[11]報(bào)告用新開發(fā)第二代數(shù)字PCR 技術(shù)進(jìn)行CTCs 檢測，為肝癌提供了特異性和敏感性很高的檢測手段。

1.2CTCs 在肝癌肝移植前的評估及術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測中的作用 由于肝癌患者行肝移植后，較早發(fā)生移植肝的腫瘤轉(zhuǎn)移，人們注意到這是否與患者移植術(shù)前的CTCs 陽性有關(guān)。馮錦城等[12]對42 例肝移植前影像學(xué)檢查無肝外轉(zhuǎn)移灶的患者，用cellsearch system 檢測術(shù)前CTCs 并隨訪1 年，結(jié)果顯示，肝移植前CTCs 陽性者29/42 例（69%），隨訪期間20 例復(fù)發(fā)（其中18 例CTCs 陽性），認(rèn)為肝移植術(shù)前血中CTCs 陽性者，移植后易發(fā)生早期腫瘤復(fù)發(fā)，CTCs 可以作為判斷肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)時間的獨(dú)立指標(biāo)。Wang等[13]報(bào)告，CTCs 定期檢測可評估肝移植后療效和腫瘤復(fù)發(fā)。

1.3CTCs 與治療及預(yù)后的關(guān)系

1.3.1肝癌術(shù)后療效的判斷 Huang 等[14]將肝癌術(shù)后患者共117 例分成兩組，肝動脈化療栓塞（TACE）組和對照組，TACE 組在術(shù)后1 個月再行TACE 治療，并分別于TACE 術(shù)前1 天、術(shù)后定期多次檢測患者CTCs，對照組術(shù)后未行TACE，結(jié)果顯示，TACE 組的CTCs 平均計(jì)數(shù)和肝癌復(fù)發(fā)率均明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05），從而認(rèn)為肝癌術(shù)后行TACE 治療是有效的，CTCs 可作為療效判斷的依據(jù)和評估預(yù)后與復(fù)發(fā)的指標(biāo)。有研究已經(jīng)證實(shí)，檢測治療前后CTCs 數(shù)量上的變化，可以了解肝癌細(xì)胞對治療的敏感性和增殖活性[5]。

1.3.2預(yù)后的判斷 CTCs 數(shù)量增加往往提示對治療不敏感，預(yù)后差。劉子鑫等[15]研究也證實(shí)了這一結(jié)果。沈敏娜等[16]對481 例惡性腫瘤患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者陽性檢出率為53%，并對CTCs 進(jìn)行CK 染色后觀察其治療前后形態(tài)，體積和細(xì)胞核的變化：（1）治療后體積有變化者治療反應(yīng)及預(yù)后好；（2）體積穩(wěn)定組治療反應(yīng)不佳；（3）CK 染色增強(qiáng)組預(yù)后不良；（4）CTCs 凋亡組預(yù)后良好。王喜術(shù)等[17]對111 例原發(fā)性與56 例復(fù)發(fā)性肝癌患者各表型CTCs 陽性率比較，顯示肝癌不同表型的陽性率與其臨床病理特征具有顯著相關(guān)性。王春梅等[18]用吉替奧治療原發(fā)性肝癌根治術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性患者，將56 例患者分為治療組和對照組，觀察治療后CTCs 數(shù)目、毒副作用和無瘤生存時間，結(jié)果顯示：治療組1 個月后明顯下降，無瘤生存期延長，未增加毒副作用。曾健瀅等[19]研究表明，AFP 水平與檢出個數(shù)呈正相關(guān)，提示CTCs 檢測有較好的臨床應(yīng)用價值。

2 循環(huán)游離核酸

Mandel 和Metais[20]首次提出了細(xì)胞外游離核酸的概念。他們發(fā)現(xiàn)在人體血液循環(huán)中，存在游離于細(xì)胞外的微量內(nèi)源性或外源性核酸片段，進(jìn)一步研究證實(shí)，其主要來源于循環(huán)中細(xì)胞的裂解或凋亡壞死細(xì)胞的主動釋放，包括循環(huán)游離DNA、游離微小RNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA 等，也可以由于機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞或者手術(shù)刺激等導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死破裂，形成的核酸被動釋放。多項(xiàng)研究顯示，HCC 循環(huán)游離DNA 水平越高，則疾病嚴(yán)重程度越高[11]。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）通常是指腫瘤細(xì)胞凋亡后進(jìn)入外周血循環(huán)的游離核酸，一般由70～200 個堿基對組成，目前在液體活檢中研究較多。通過對肝癌患者血液中的ctDNA 研究，可以隨時了解患者手術(shù)治療前后的變化，評估藥物治療后的療效以及對預(yù)后的判斷。Xu 等[21]報(bào)告ctDNA 甲基化標(biāo)志物可用于肝癌的診斷、病情監(jiān)測。他們將大樣本的肝癌患者ctDNA 甲基化應(yīng)用于肝癌診斷，并設(shè)置正常對照組的相關(guān)性研究，結(jié)果顯示，ctDNA 有較好的臨床應(yīng)用前景。Mansour 等[22]通過對肝癌患者ctDNA 攜帶的Ras 相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）甲基化水平的研究，支持了這一結(jié)論。Yan 等[23]研究表明，循環(huán)游離DNA 聯(lián)合AFP 檢測提高了對肝癌的診斷準(zhǔn)確率。

有研究證明，外周血中ctDNA 數(shù)量與腫瘤負(fù)荷成正比[24]。ctDNA 的半衰期時間很短，一般在15min～2.5h，因此，短暫的半衰期意味著我們檢測ctDNA 得到的腫瘤信息也是短暫的。目前，ctDNA 的檢測方式主要有兩大類，一類是基于PCR 技術(shù)，其敏感性較高，但只能檢測已知的突變位點(diǎn)。另一類是基于二代測序（NGS）技術(shù)，可檢測未知突變，但檢測過程復(fù)雜，成本高，耗時長。

3 外泌體

外泌體是存在于細(xì)胞外的微小脂質(zhì)囊泡，直徑為50～140nm，形似茶托，可由各型細(xì)胞的胞吐作用釋放到細(xì)胞外微環(huán)境，攜帶有多種生物學(xué)信息的外泌體通過與特定“靶細(xì)胞”表面受體相結(jié)合，將信息傳遞給其他細(xì)胞，從而影響腫瘤代謝甚至轉(zhuǎn)歸[3]。目前認(rèn)為，不同細(xì)胞來源的外泌體具有不同的成分與功能，并受到細(xì)胞微環(huán)境的動態(tài)影響；對人體的生理與病理過程有重要作用，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。

多項(xiàng)研究表明，外泌體參與肝癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能為：（1）介導(dǎo)肝癌細(xì)胞間通訊；（2）介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞間通訊；（3）調(diào)節(jié)肝癌組織微血管生成[25]。作用的途徑：通過改變組織的微環(huán)境，直接融合、與表面蛋白結(jié)合和胞吞作用三種方式作用于靶細(xì)胞[19]。

齊寒等[26]在肝癌轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型上，系統(tǒng)評估不同來源的外泌體對肝癌生長、轉(zhuǎn)移及免疫微環(huán)境的影響，結(jié)果提示Hepa1-6 細(xì)胞來源的外泌體對肝癌生長和肺轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用，但對肝癌免疫微環(huán)境無明顯調(diào)控作用；而肝癌原位移植瘤小鼠血清來源的外泌體能促進(jìn)肝癌生長、肺轉(zhuǎn)移。黃修燕等[27]通過將高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞外泌體與低轉(zhuǎn)移潛能肝癌共培養(yǎng)，促進(jìn)了低轉(zhuǎn)移潛能肝癌侵襲能力，認(rèn)為與外泌體circRNA-100338 水平提高及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）活性增強(qiáng)有關(guān)。外泌體攜帶的信息多種多樣，可能通過不同種類miRNAs 的異常表達(dá)間接調(diào)控肝癌細(xì)胞[27]，周圍組織細(xì)胞借助其分泌的外泌體相互作用，促進(jìn)或者抑制腫瘤的生長。例如，肝癌患者血清外泌體miR-665 水平明顯升高。其水平與腫瘤直徑、局部浸潤、臨床分期和生存時間均密切相關(guān)，由于外泌體具有反映疾病狀態(tài)的能力和細(xì)胞通訊作用，其可作為肝癌的診斷、復(fù)發(fā)及預(yù)后生物標(biāo)志物，并且有望用于肝癌的治療[28]。

液體活檢有多種方法，目前最新采用的高通量測序、PCR 等手段，對檢出極微量的腫瘤來源核酸等標(biāo)志物具有很高的敏感性，因此可以用于腫瘤的早期乃至超早期篩查。在湯釗猷院士和樊嘉院士的指導(dǎo)下，上海中山醫(yī)院肝腫瘤外科周儉教授團(tuán)隊(duì)[29-30]率先開展了“建立miRNA 肝癌早期診斷新技術(shù)”，構(gòu)建的miRNA 早期診斷模型，靈敏度較AFP 提高30%，并轉(zhuǎn)化研制出國際首個miRNA 肝癌檢測試劑盒，多中心臨床試驗(yàn)證實(shí)提高了早期和極早期肝癌的檢出率。他們在CTCs 的研究中證實(shí)，外周血EpCAM+CTCs 是肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的“種子”，可作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，研制出國際首臺CTC 分選檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了同類進(jìn)口設(shè)備的替代和升級[16]。

4 問題及展望

“液體活檢”或稱“血液活檢”，與活體組織檢查比較有很大的優(yōu)勢[31]。外周血標(biāo)本是臨床上理想的標(biāo)本來源，無創(chuàng)易采，目前，液體活檢研究的CTCs、ctDNA 及外泌體等，在基礎(chǔ)和臨床研究中取得了一系列進(jìn)展，但還存在下列問題[10，32]。

4.1肝癌表型與臨床特征的關(guān)系 肝癌細(xì)胞有不同的表型，各表型之間及其與臨床特征的關(guān)系還未完全弄清，需要進(jìn)一步探索，目前應(yīng)用PCR 和NGS 技術(shù)，可在單細(xì)胞水平了解基因的信息變化，將有助于此研究[33]。

4.2液體活檢技術(shù)的完善 上述的幾種液體活檢方法，由于多種原因，還未能廣泛應(yīng)用于臨床，下一步需要：（1）更加高效、敏感、價廉的富集檢測和純化，冷儲設(shè)備；（2）規(guī)范統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和操作流程，使各科研結(jié)果利于比較和可重復(fù)性；（3）開展多中心、大樣本的臨床研究，并有望在分子生物學(xué)水平進(jìn)一步闡述腫瘤發(fā)展機(jī)制，從而為肝癌患者臨床分期、預(yù)后判斷及個體化診治帶來新的希望。

4.3肝癌細(xì)胞異質(zhì)性的挑戰(zhàn) 當(dāng)前，肝癌的診斷與治療面臨最大的挑戰(zhàn)是肝癌的高度異質(zhì)性，表現(xiàn)為在同一時空，不同腫瘤部位的癌細(xì)胞可能有不同的癌基因表達(dá)，以及在不同時空，腫瘤基因組的不穩(wěn)定性；另外，缺乏特異的診斷標(biāo)志物，很難對肝癌進(jìn)行分子病理水平的精準(zhǔn)診斷和治療。而液體活檢恰恰可以克服上述診治上的難點(diǎn)，給未來的發(fā)展提供更大的空間和機(jī)遇。

4.4展望 通過對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和高通量技術(shù)進(jìn)一步研究，找出肝癌細(xì)胞異質(zhì)性，分析細(xì)胞亞群之間的關(guān)系，將液體活檢技術(shù)引入到原發(fā)性肝癌的篩查、診斷和臨床分期及療效和預(yù)后評價，在肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療中發(fā)揮獨(dú)特作用。