不同培養(yǎng)條件對栗仁菌核青霉菌生長的影響

霍佳歡 李雙民 溫曉蕾 馮麗娜 李雅麗 張娜娜 蘭淑慧 齊慧霞

摘要：菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）是板栗儲藏期引起栗仁腐爛的主要致病菌之一。為明確該病菌生長及產孢的適宜環(huán)境條件，本試驗采用生長速率法和血球計數(shù)法對不同營養(yǎng)、溫度、pH值、通氣狀況等條件下病菌的生長情況進行了研究。結果表明，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;沙堡弱培養(yǎng)基最適合該病菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產孢;菌核青霉菌在以木糖醇為基礎碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大、產孢量最多;菌絲生長的最佳氮源為牛肉膏，產孢量最多的氮源為蛋白胨和酵母浸粉;菌絲體在24 h連續(xù)振蕩的條件下生長的最好;50 ℃為菌核青霉菌致死溫度。

關鍵詞：板栗;栗仁腐爛病;菌核青霉菌;培養(yǎng)條件

中圖分類號： S436.64? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0129-04

收稿日期：2021-03-25

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2020YFD1000700）;河北省教育廳平臺項目（河北省板栗產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，2019—2023年）。

作者簡介：霍佳歡（1997—），女，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向為板栗病害流行與防控，E-mail：2469634717@qq.com;共同第一作者：李雙民（1968—），男，河北昌黎人，中學高級教師，研究方向為果樹病蟲害防治，E-mail：lishuangmin2021@163.com。

通信作者：溫曉蕾，碩士，實驗師，研究方向為分子植物病理學，E-mail：xiaoleiwen@sina.com;齊慧霞，碩士，教授，研究方向為植物病害流行與防控，E-mail：qihuix@163.com。

栗仁腐爛病是板栗生產上的常見病害之一，在南北方各板栗產區(qū)均有發(fā)生，近年來因板栗產量的大幅度提高，栗仁腐爛率也隨之增加，危害率高達40%～50%，嚴重制約著板栗產業(yè)的發(fā)展[1-2]。栗仁腐爛病常發(fā)生于貯藏期間，多由病原微生物引起，常見的有鐮刀菌屬、鏈格菌屬、單端孢屬、青霉屬以及曲霉屬等[3]，其中青霉屬在全國各板栗產區(qū)均可危害，造成栗仁發(fā)生青腐，產生褐色或青色的病斑，后期轉為藍綠色或青綠色[4]。目前板栗上已報道的青霉種類有小刺青霉、擴展青霉以及擬青霉等[5-7]，而對菌核青霉的研究相對較少。本試驗對引起貯藏期栗仁腐爛的菌核青霉菌其適宜培養(yǎng)條件進行研究，以期為制定有效的防腐保鮮措施提供科學依據(jù)，減少不必要的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019—2020年在河北科技師范學院植物保護實驗室開展。栗仁菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）由河北科技師范學院植物保護實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 在無菌超凈臺內，將直徑5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅分別接種到玉米粉、胡蘿卜、番茄、沙堡弱、燕麥馬鈴薯、綠豆、肉汁胨、板栗培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基各設3個重復，均于25 ℃全黑暗條件下培養(yǎng)。每間隔24 h采用十字交叉法[8]測量菌落直徑，菌落生長14 d時采用血球計數(shù)法測定孢子數(shù)量[9]。

1.2.2 溫度對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 超凈臺內將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于馬鈴薯葡萄球瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中央，分別放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個溫度均設3次重復，菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 光照對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 超凈臺內將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，設置不同光照（24 h光照、12 h 光照/黑暗、24 h黑暗）條件，25 ℃下培養(yǎng)，每個處理重復3次。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4 不同pH值對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，制成pH值為5、6、7、8、9、10、11的7種不同培養(yǎng)基，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，在25 ℃全黑暗條件下進行培養(yǎng)，每種pH值設3次重復，菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.5 碳源對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 將察氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別用等量的肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇和乳糖替換察氏培養(yǎng)基中的蔗糖[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每種碳源設3個重復，25 ℃全黑暗條件下培養(yǎng)。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.6 氮源對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 基礎培養(yǎng)基同上，以等量的牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母浸粉和氯化銨替換察氏培養(yǎng)基中硝酸鈉[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每個處理重復3次，25 ℃黑暗下培養(yǎng)。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.7 通氣狀況對菌絲生長的影響 將液體PDA培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶100 mL，將3個直徑為0.5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅在超凈臺內接種到三角瓶內，在溫度為25 ℃，轉速為120 r/min搖床內分別24 h振蕩、12 h振蕩/12 h靜止、24 h靜止培養(yǎng) 5 d，每個處理設3次重復。5 d以后，將菌絲通過紗布過濾，用烘箱烘干（直到不含有任何水分），稱量菌絲干質量[11]。

1.2.8 致死溫度的測定 菌核青霉菌生長初期，未產孢之前（2 d以內）轉入裝有5 mL無菌水的試管中，每個處理標好編號，設置3個重復，將各試管按照不同編號依次放入40、45、50、55、60、65 ℃水浴鍋中，水浴10 min，然后將處理后的菌餅接種到PDA培養(yǎng)平板中央。25 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌絲生長情況，明確致死溫度。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表1可知，栗仁菌核青霉菌在8種培養(yǎng)基上均可生長，最適合菌核青霉菌生長的培養(yǎng)基為沙堡弱培養(yǎng)基，14 d菌落直徑達7.95 cm;其次為板栗培養(yǎng)基，菌落直徑可達6.98 cm。適宜菌核青霉菌產孢的培養(yǎng)基為燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d產孢量可達6.99×105個/皿。表明沙堡弱培養(yǎng)基最適合菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產孢。

2.2 溫度對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表2可知，溫度對病原菌菌絲生長和產孢量均有顯著影響，栗仁菌核青霉菌在10～30 ℃條件下均能生長，最佳的生長溫度范圍在20～30 ℃，其中在25 ℃條件下菌落生長最好，14 d時菌落直徑可達到6.33 cm;同時25 ℃也最適合產孢，14 d時產孢量為3.76×105個/皿。溫度低于5 ℃或高于35 ℃時菌落生長十分緩慢，略有菌絲產生。

2.3 光照對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表3可知，在3種不同光照條件下，栗仁菌核青霉菌以全黑暗條件下生長最快，14 d時菌落直徑達6.8 cm。24 h光照和12 h光照/黑暗條件下菌落直徑相對較小，分別為6.02 cm和5.83 cm，且這2處理對菌核青霉菌菌絲生長的影響無顯著差異。全黑暗、全光照和12 h光照/黑暗3個處理對菌核青霉菌產孢量影響無顯著差異，14 d時產孢量分別為3.95×105、3.63×105、3.73×105個/皿。表明菌核青霉菌在黑暗條件下更易于菌絲生長和產孢。

2.4 不同pH值對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

栗仁菌核青霉菌在7種不同pH值上生長狀態(tài)如表4所示，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產孢的pH值為6，培養(yǎng)14 d菌落直徑達6.62 cm;產孢量為3.70×105個/皿。pH值為11時，菌落生長較慢，培養(yǎng) 14 d 菌落直徑為5.93 cm;pH值為5時，不適宜其產孢，培養(yǎng)14 d產孢量為2.35×105個/皿。

2.5 碳源對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表5可知，菌核青霉菌在8種不同碳源上均能生長，菌絲在以木糖醇為碳源的培養(yǎng)基上生長的最好，菌落直徑最大、產孢量最多，培養(yǎng)14 d菌落直徑為6.02 cm，產孢量為4.27×105個/皿;菌絲對可溶性淀粉的利用能力最低，培養(yǎng)14 d菌落直徑僅為3.45 cm。

2.6 氮源對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表6可知，栗仁菌核青霉菌在以牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨為基礎氮源的培養(yǎng)基上生長的好，其中以牛肉膏的利用率最高，14 d時的菌落直徑為 7.68 cm;該病菌在以酵母浸粉和硝酸鈉為基礎氮源的培養(yǎng)基上菌落擴展相對較慢。供試氮源培養(yǎng)基中以蛋白胨和酵母浸粉的產孢數(shù)量大，14 d時產孢量分別為4.79×105、4.80×105個/皿，二者之間無顯著差異。

2.7 通氣狀況對菌核青霉菌生長的影響

由圖1可知，菌核青霉菌在不同通氣狀況下菌絲生長有較為顯著的差異，該病菌在24 h振蕩條件下菌絲生長的最好，培養(yǎng)5 d菌絲干質量可達 0.40 g;在24 h靜止和12 h振蕩/12 h靜止下該病菌菌絲生長相對較慢，5 d時菌絲干質量分別為0.21 g和0.16 g，由此可見菌核青霉菌在通氣良好的條件下更適宜生長。

2.8 致死溫度測定結果

將栗仁菌核青霉菌菌餅分別在40、45、50、55、60、65 ℃不同溫度的水浴鍋中處理10 min后，轉移到PDA平板中央25 ℃培養(yǎng)48 h，結果（圖2）表明，在40 ℃和45 ℃條件下處理的菌絲均可繼續(xù)生長，在50、55、60、65 ℃條件下處理過的菌絲則停止生長。因此可確定栗仁菌核青霉菌菌絲的致死溫度為50 ℃。

3 結論與討論

本試驗結合菌絲生長量和產孢量2個標準來衡量菌核青霉菌的適宜培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，沙堡弱培養(yǎng)基最適合菌核青霉菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產孢;最適宜菌絲生長和產孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;栗仁菌核青霉菌對木糖醇的利用率最高，在以木糖醇為基礎碳源的培養(yǎng)基上菌絲最適宜生長、產孢量最大;氮源中最適宜菌絲生長的為牛肉膏，但最適宜產孢的為酵母浸粉和蛋白胨;在24 h連續(xù)振蕩培養(yǎng)條件下最適合菌絲生長，培養(yǎng)5 d后菌落干質量達0.40 g。

郜海燕等指出，最適合擴展青霉生長的pH值為8，最適宜菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉，這與菌核青霉略有不同[12]。王俊鳳等認為小刺青霉菌最適宜的生長溫度為20 ℃，pH值為7，最適宜菌絲生長和產孢的碳源分別為可溶性淀粉和甘露醇;同時適宜菌絲生長和產孢的氮源為酵母浸粉[5]。菌核青霉菌和小刺青霉菌雖同為青霉屬，且均為腐爛病的致病菌，但二者適宜生長條件具有一定差異，可能因病菌生長環(huán)境和種間差異所引起。丁仁惠等研究發(fā)現(xiàn)指狀青霉和意大利青霉的致死溫度分別為80 ℃和75 ℃，與菌核青霉的致死溫度50 ℃略有不同，此差異可能是因生長環(huán)境不同或因寄主不同所導致[13]。本研究明確了栗仁菌核青霉菌對環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求，為有效預防和防治由菌核青霉菌引起的栗仁腐爛病提供理論支撐，具體防腐方法還需進一步研究探討。

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