基于高密度遺傳圖譜定位水稻籽粒長寬比QTL

梁文化 陳濤 姚姝 趙凌 朱鎮(zhèn) 趙慶勇 周麗慧 趙春芳 路凱 赫磊 王才林 張亞東

摘要：挖掘水稻籽粒長寬比相關的QTL可為水稻粒型的遺傳機制研究提供理論基礎。以特大粒水稻TD70和小粒秈稻Kasalath構(gòu)建的重組自交系群體為研究材料，2019、2020年連續(xù)2年考察各株系的籽粒長寬比，利用群體重測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜對控制水稻籽粒長寬比相關QTL進行分析。結(jié)果顯示，在重組自交系群體中籽粒長寬比呈連續(xù)變異，有明顯的超親分離現(xiàn)象。2019、2020年2年共檢測到11個QTLs，分別位于2、3、4、5、6、7、9號染色體上。QTL的LOD值介于3.74～31.41之間，單個QTL可解釋2.48%～24.67%的表型變異，2年重復檢測到的QTL位點共有4個。進一步分析發(fā)現(xiàn)，qLWR2-2、qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR4、qLWR5、qLWR6-2及qLWR7共7個位點所在區(qū)間與前人的報道相同或相似。qLWR2-1、qLWR6-1、qLWR9-1和qLWR9-2可能是新發(fā)現(xiàn)的QTL位點。本研究結(jié)果可用于下一步QTL的克隆及分子標記輔助選擇育種。

關鍵詞：水稻;重組自交系;長寬比;QTL定位;高密度遺傳圖譜

中圖分類號：S511.03? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0047-05

收稿日期：2021-10-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：31901485）;江蘇省重點研發(fā)計劃（編號：BE2021301）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（編號：CARS-01-67）。

作者簡介：梁文化（1984—），男，山東臨沂人，博士，助理研究員，主要從事水稻粒型基因研究。E-mail：liangwenhua0228@126.com。

通信作者：張亞東，博士，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn。

水稻產(chǎn)量由粒質(zhì)量、每穗粒數(shù)及穗數(shù)構(gòu)成，籽粒形態(tài)決定粒質(zhì)量，同時還影響稻米的外觀品質(zhì)和商品價值。粒型包括粒長、粒寬、粒厚和長寬比[1-3]，是典型的多基因控制數(shù)量性狀，目前通過遺傳作圖、關聯(lián)分析、群體測序分析等方法鑒定水稻粒型相關的QTL已經(jīng)超過500個，這些QTL分布在水稻的12條染色體上，目前已經(jīng)被克隆和功能驗證的超過30個[4-5]。其中，GS3[6]、qGL3[7]、GL7/GW7[8-9]、GL4[10]、GL3.3/TGW3[11-12]、GLW7[13]、GLA[14]、GS9[15]等是調(diào)控粒長的QTLs，GW2[16]、GSE5/GW5/qSW5[17-19]、GS5[20]、GW8[21]等對粒寬有調(diào)控作用，TGW6[22]和GW6a[23]是千粒質(zhì)量的主效QTLs，SRS5[24]、GS2/GL2[25-26]是通過與其他基因互作調(diào)控籽粒發(fā)育的。

長寬比是水稻籽粒重要的性狀之一，對稻米品質(zhì)有重要的影響。目前，雖然已經(jīng)對水稻粒長、粒寬和千粒質(zhì)量相關QTLs展開了廣泛研究，但是水稻籽粒長寬比QTL仍然沒有被精細定位和克隆。遺傳群體的構(gòu)建對于QTL的研究至關重要，與其他分離群體不同，重組自交系群體中每個株系的基因型都是純合的，方便多年多點試驗，可挖掘出更多的遺傳信息，適合進行數(shù)量性狀的研究。筆者所在實驗室前期以特大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath為親本構(gòu)建了重組自交系群體群體，對雙親和群體株系重測序構(gòu)建了高密度遺傳圖譜[27]。在此基礎上，本研究在不同年份分別考察雙親及群體的籽粒長寬比并進行QTL關聯(lián)分析。2019—2020年2年的結(jié)果顯示，共定位到11個籽粒長寬比相關的QTLs，為下一步籽粒長寬比基因的克隆、研究長寬比的遺傳機制以及在水稻育種中研究和利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

特大粒粳稻TD70是天鵝谷///9520//（72-496/蘇御糯）雜交后代選出的穩(wěn)定品系，以TD70與印度小粒秈稻品種Kasalath為親本，雜交產(chǎn)生F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，進一步通過單籽傳法構(gòu)建TD70/Kasalath的重組自交系群體，連續(xù)自交至F14代，最終獲得包含186個株系的重組自交系群體[28]。2019、2020年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗田種植重組自交系群體及2個親本，每個株系種植4行，每行8 株，行距為26.7 cm，株距為16.7 cm，田間管理與大田相同。

1.2 性狀調(diào)查

成熟時每個小區(qū)隨機選取5株混合收種，自然晾干保存。從親本及每個重組自交系株系中隨機挑選10粒飽滿種子，用游標卡尺（精度0.01 mm）測量粒長、粒寬，根據(jù)粒長和粒寬計算稻谷的長寬比，重復3次，以平均值作為性狀的表型值。

1.3 QTLs定位

前期利用重測序技術對重組自交系群體186個株系及2個親本分別進行全基因組重測序，參考Huang等的方法構(gòu)建高密度的Bin-map[29]。該圖譜包含12 328個Bin 標記，平均每條染色體上有1 027 個，相鄰Bin標記間的物理距離平均為 30.26 kb[27]。采用軟件IciMapping Ver 4.2.53中的ICIM-ADD算法對2019、2020年重組自交系群體長寬比表型分別進行QTL定位。作圖設定PIN為0.001，步長為1 cM，LOD閾值設定為3.0[30]。以LOD峰值作為該QTL 的LOD值，并計算每個QTL對水稻籽粒長寬比的貢獻率和加性效應，遵循McCouch的方法等原則對QTL進行命名[31]。采用Mapchart V2.32軟件繪制QTL在染色體上的位置分布[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及重組自交系群體籽粒的長寬比

2019、2020年對親本TD70、Kasalath及186個重組自交系株系長寬比進行考察。結(jié)果表明，TD70長寬比分別為2.63±0.13、2.68±1.11，Kasalath長寬比分別為3.07±0.23、3.00±0.15。對親本籽粒大?。▓D1）的2年數(shù)據(jù)進行t測驗，結(jié)果顯示，親本間長寬比均存在極顯著差異（表1）。重組自交系群體2年長寬比分別為2.30～4.58、2.22～4.43，呈現(xiàn)出廣泛的變異，平均值分別為3.15±0.53、3.12±0.50（表1）。對長寬比的頻率分布及峰值進行分析，結(jié)果顯示，2年的籽粒長寬比均呈現(xiàn)連續(xù)變異的近正態(tài)分布（圖2），表現(xiàn)出受多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特征，2年間的變化趨勢相似，且存在超親分離現(xiàn)象，符合QTL區(qū)間作圖分析的要求。

2.2 籽粒長寬比QTL定位

利用前期研究構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，連續(xù)2年對親本及186個重組自交系株系的籽粒長寬比數(shù)據(jù)進行考察，采用QTL IciMapping V 4.2.53軟件的ICIM-ADD算法進行QTL作圖及分析。結(jié)果（圖3）表明，2年共檢測到11個與籽粒長寬比相關的QTLs，分別位于2、3、4、5、6、7、9號染色體的不同位置。籽粒長寬比QTL在染色體上的分布并不均勻，其中，2、3、6、9號染色體分別檢測到2個QTLs;4、5、7號染色體分別檢測到1個QTL。qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR5和qLWR6-1等4個QTL在2019、2020年2年均被檢測到，說明這4個QTL受環(huán)境影響小，遺傳較穩(wěn)定。

2.3 籽粒長寬比QTL分析

對檢測到的11個QTLs進一步分析，發(fā)現(xiàn)QTL的LOD值最小為3.74，最大為31.41，貢獻率在248%～24.67% 之間。 2年分析結(jié)果（表2） 顯示，這些QTL分別解釋74.55%和74.69%的表型變異。其中，qLWR2-2位于2號染色體，LOD值為14.52，貢獻率為9.00%，定位在標記Bin1570～Bin1571之間;qLWR4位于4號染色體，LOD值為410可解釋2.68%的表型變異。2019、2020年2年均檢測到的QTL有4個：qLWR3-1的2年貢獻率分別為12.26%和1499%，加性效應均為0.18;qLWR3-2的2年貢獻率分別為13.07%和1126%，加性效應分別為 -0.19 和-0.16;qLWR5位于5號染色體上，貢獻率最大，2年貢獻率分別為24.67%和22.70%，加性效應分別為0.25和0.23;qLWR6-1的2年貢獻率分別為4.90%和6.95%，加性效應分別為-0.11和-0.12。進一步分析發(fā)現(xiàn)，QTLs定位物理區(qū)間在11 332～68 084 bp之間，其中qLWR3-1、qLWR3-2分別定位在11 332、32 249 bp 的染色體區(qū)段內(nèi);qLWR5定位在 30 824 bp 物理區(qū)間內(nèi);qLWR6-1被定位在 27 693 bp 的物理區(qū)間內(nèi);qLWR7定位于7號染色體上 29 299 bp 物理區(qū)間（表2）。

3 討論與結(jié)論

水稻粒型與粒質(zhì)量密切相關，且對產(chǎn)量和品質(zhì)均有影響[1]。在水稻長寬比相關的QTL研究方面，方先文等以秈稻扎西瑪與優(yōu)質(zhì)粳稻南粳46構(gòu)建了重組自交系群體，利用202對SSR標記進行籽粒性狀的QTL分析，檢測到6個長寬比相關的QTL[33]。

梁云濤等構(gòu)建了F2群體，利用184對SSR標記共檢測到3個粒型QTL，表型貢獻率為10.56%～1477%，QTL物理區(qū)間為254 720～407 666 bp[34]。李金吉等利用大粒品種和東北小粒中的F2群體的156對多態(tài)SSR標記定位到5個長寬比相關的QTL，分別位于水稻2、3、5號染色體上，貢獻率為4%～18%，其中，qL/W-2-1和qL/W-2-2均位于1 274 508 bp物理區(qū)間內(nèi)，qL/W-3-1定位區(qū)間為2 706 165 bp[35]。前人通過構(gòu)建不同的遺傳群體對粒型QTL進行檢測，但是傳統(tǒng)的分子標記構(gòu)建的遺傳圖譜不夠精細，因而定位到的QTL位點區(qū)間較大，后續(xù)難以進行精細定位和候選基因的克隆工作。

利用2代測序技術構(gòu)建高密度遺傳圖譜對QTL的定位更加精細，徐建軍等利用重測序技術構(gòu)建了包含401個Bin的遺傳圖譜，定位到8個粒型QTL，定位區(qū)間為200 070～5 792 954 bp[36];衛(wèi)純潔等利用該群體定位到4個水稻籽粒長寬比相關的QTL，定位區(qū)間在17 825～945 168 bp之間[37]。張健等以特異矮桿突變體CHA-1為母本、以秈稻H335為父本構(gòu)建了275個重組自交系群體，利用簡化基因組測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜包含2 498個Bin標記，利用該圖譜共檢測到26個籽粒大小相關的QTL，最小定位區(qū)間為90 416 bp[38]。由此可見，2代高通量測序構(gòu)建的圖譜確實優(yōu)于傳統(tǒng)的分子標記圖譜，這可能是重測序獲得的基因組變異信息更全面，因而圖譜標記密度更大，也較均勻。筆者所在實驗室前期研究對重組自交系群體186個株系進行全基因組重測序，由于是秈粳交后代基因組差異大，因而SNP位點較多，過濾掉低質(zhì)量的位點后最終構(gòu)建的圖譜包含12 328個Bin 標記，相鄰標記間平均物理距離僅為30.26 kb[27]。本研究利用該圖譜對長寬比進行QTL分析，結(jié)果表明，11個長寬比相關的QTL定位區(qū)間最小為11 332 bp，最大為 68 084 bp，平均為30 083 bp的定位區(qū)間較精細，有助于后續(xù)對基因的克隆和功能分析。

本研究中qLWR2-2和qLWR7所在區(qū)間與張亞東等對粒型QTL定位的區(qū)間[28，35]相近，深入分析發(fā)現(xiàn)，這2個區(qū)間內(nèi)分別存在已知粒型基因GW2和GL7/GW7[8，9，16]。qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR5是2年均檢測到的主效QTL位點，定位區(qū)間與前人相關的研究結(jié)果一致，且區(qū)間內(nèi)分別存在已知的粒型基因GS3、qGL3和GW5[28，38]。qLWR4、qLWR6-2分別位于4、6號染色體上，該區(qū)間附近存在已克隆的粒型相關基因D11和TGW6[22，39]。qLWR2-1、qLWR6-1、qLWR9-1和qLWR9-2等4個QTL位點所在區(qū)間未見相關報道，可能是本研究新發(fā)現(xiàn)的位點，其中，qLWR6-1在2019、2020年2年均檢測到，說明該位點遺傳較穩(wěn)定，后續(xù)試驗將對4個新的位點進一步驗證并深入研究。本研究通過高密度Bin圖譜定位到控制籽粒長寬比相關QTL位點，既包含前人已經(jīng)定位或克隆的粒型基因，也發(fā)現(xiàn)4個新的QTL位點，有利于下一步相關基因的深入研究和分子標記輔助育種應用。

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