植物中硼在微觀水平上的作用機制及研究展望

楊萬霞 陳松峰

摘要：硼是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，在植物正常的生命活動中發(fā)揮著重要作用。隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、轉錄組學等現(xiàn)代技術手段的不斷應用，人們對植物中的硼研究也逐漸深入。本文綜述了近年來植物中的硼在組學水平上的研究進展，組學技術在構建硼高密度遺傳圖譜、尋找與硼吸收轉運相關的轉錄因子、硼介導的代謝途徑方面的重要作用，可以為研究不同硼水平下植物響應的差異、提高硼利用效率和減弱植物遭受硼毒害的響應機制研究提供一定思路。

關鍵詞：硼;基因組學;蛋白質(zhì)組學;代謝組學;轉錄組學

中圖分類號： S718.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0034-07

收稿日期：2021-04-26

基金項目：南京林業(yè)大學青年創(chuàng)新基金（編號：CX2018007）;江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）。

作者簡介：楊萬霞（1978—），女，山東東阿人，博士，講師，主要從事人工林定向培育和木本藥用植物的次生代謝研究。E-mail：yangwanxia@njfu.com.cn。

根據(jù)植物必需營養(yǎng)元素的確定標準，目前人們已經(jīng)確定17種植物必需營養(yǎng)元素，其中微量元素有鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、鎳、鈉等9種[1]，這些必需營養(yǎng)元素在植物生長發(fā)育與形態(tài)建成、物質(zhì)代謝與能量轉化、信息傳遞與信號轉導等方面的作用是不可替代的[2]。Warington在1923年通過對蠶豆的試驗發(fā)現(xiàn)，硼是高等植物維持生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素[3]。此后，為了明確硼在植物生長發(fā)育中的功能，人們進行了大量研究。一開始的研究主要集中于高硼、低硼逆境脅迫對植物生長的影響及耐脅迫的生理機制、硼與植物光合作用的關系[4-6]、硼與細胞結構和功能的關系[7]、硼在植物體內(nèi)的運輸機制及分布方式[8-9]、硼與植物生長物質(zhì)之間的關系[10]、硼與植物發(fā)育生理的關系、硼對體內(nèi)相關代謝酶活性的影響[11]等生理方面。隨著科研技術手段的不斷發(fā)展，研究內(nèi)容也越來越深入，基因組學（genomics）、蛋白質(zhì)組學（proteomics）、代謝組學（metabonomics）、轉錄組學（transcriptomics）等一系列先進的分析方法被應用到植物生命機制的探索中，為更深層次地了解植物生長、發(fā)育、代謝、疾病、衰老的全過程并為改良植物品種、優(yōu)質(zhì)品種選育、確保食品安全奠定了良好基礎[12-16]。本文對這些組學水平上的研究方法展開綜述，以期在前人研究的基礎上，為后續(xù)該方面的研究提供一些思路和啟發(fā)。

1 基因組學水平的研究進展

基因組的概念始于1920年，但是發(fā)展得比較緩慢，直到1986年美國科學家Thomas Roderick正式提出基因組學的概念[17]。目前基因組學的主要研究方向包括結構基因組學（structural genomics）、功能基因組學（functional genomics）和比較基因組學（comparative genomics）。結構基因組學的主要研究手段為利用數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）定位及DNA測序技術（全基因組鳥槍法和克隆重疊群法）研究基因組的遺傳圖譜和物理圖譜。功能基因組學利用結構基因組學提供的信息和產(chǎn)物，主要借助基因表達的系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）、cDNA微陣列（cDNA microarray）和DNA芯片（DNA chip）、蛋白質(zhì)組學、生物信息學及反向遺傳學等方法對基因功能在基因組或系統(tǒng)水平進行分析。功能基因組學可以延伸至轉錄組學、表觀遺傳學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等表型組學。比較基因組學是先獲得不同物種或群體的基因組，然后再進行比較的系統(tǒng)生物學研究[17-19]。隨著一系列植物如擬南芥、水稻、玉米等陸續(xù)完成測序工作，農(nóng)業(yè)也開啟了基因水平研究的新篇章，對微量元素硼與植物之間的研究也深入到了基因?qū)用鎇20]。

Takano等利用擬南芥突變體bor1-1進行試驗發(fā)現(xiàn)，BOR1（At2g74160）基因定位于中柱鞘細胞的細胞膜上，并介導硼缺乏條件下硼在韌皮部的運輸，同時克隆出了第1個植物硼轉運子基因BOR1，為探索高等植物活性硼轉運的分子機制提供了參考;其領導的研究小組于2006年通過將2個T-DNA插入NIP5;1基因序列，導致植株根系吸收硼酸的能力降低，并導致植株對缺硼的敏感性增強，證實了NIP5;1基因在擬南芥內(nèi)向吸收硼的過程中發(fā)揮著關鍵作用;綠色熒光蛋白標記結果表明，該基因位于質(zhì)膜，是主要內(nèi)在蛋白（MIPs）家族基因的一員[9，21]。其他6個BOR1類似基因也在擬南芥基因組中鑒定出來，它們的特定性表達結果顯示，它們在植物硼運輸過程中各自發(fā)揮著不同作用，其中BOR2在根帽區(qū)、伸長區(qū)強烈表達，BOR4在應對高硼脅迫時發(fā)揮著重要作用[22-24]。除此之外，研究者還對其他一些物種的BOR1功能類似基因進行了研究，如葡萄、油菜、柑橘、玉米、番茄、水稻[25-30]等。

Liu 等研究了不同硼環(huán)境下甘藍型油菜對不同礦物含量控制的遺傳因素，通過QTL全基因組分析和上位效應分析，共鑒定出35個QTL和74個上位效應對，發(fā)現(xiàn)大部分QTL都對應2種硼狀態(tài)（正常和缺硼）下的1種。這些結果表明，植物在營養(yǎng)脅迫條件下，遺傳因素控制植物的礦物質(zhì)平衡需要調(diào)節(jié)礦物質(zhì)的量。另外，有研究者通過比較基因組分析，將26個參與擬南芥離子吸收和轉運的基因?qū)敫仕{型油菜的QTL區(qū)間，甘藍型油菜同源基因允許這些基因參與控制礦物的濃度，可能有助于QTL的鑒定[31]。隨后，研究者為揭示甘藍型油菜硼吸收效率的遺傳基礎、植物生長特性、硼的吸收特征和硼效率系數(shù)的QTL，使用雙單倍體群體分析了Qingyou10（硼高效植物）和Westar 10（硼低效植物），利用Brassica 60 K Infinium BeadChip陣列檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、簡單重復序列（SSR）和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）等技術手段，檢測到52個QTLs，構建了高密度遺傳圖譜，為甘藍型油菜的硼效率研究提供了一個新的位于A3部位的主位點，適合甘藍型油菜的基因精細定位和分子標記輔助育種[32]。研究缺硼條件下油菜的生理、轉錄、基因表達的變化有利于更全面地鑒別油菜缺硼時生理基因型、轉錄水平的響應和豐富的基因多樣性表達，而且數(shù)字基因表達譜（DGE）輔助QTL序列分析可為復雜基因組的植物數(shù)量性狀基因的快速分離提供新的思路[33]。Hua等在基因尺度上對不同硼脅迫下的mRNA轉錄進行分析，這一最新研究成果為甘藍型油菜硼穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡中關鍵成分的mRNA轉錄提供了全面認識，豐富了我們對植物適應缺乏和過量硼條件的分子機制的理解[34]。此外，Mosa等利用RT-PCR技術分析水稻基因發(fā)現(xiàn)，同屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs）亞屬的OsPIP1;3、OsPIP2;6這2種基因在高硼脅迫時表達強烈，掌握PIPs的調(diào)控機制可以顯著提升在高硼土壤上生長的作物的耐硼毒能力[35]。在大麥中，HvNIP2;1基因的表達和對硼毒的耐受性相關，當表達量下調(diào)時，限制了植物對硼的吸收[36]。Maria等在對2個不同基因型番茄進行長期、短期硼脅迫試驗時發(fā)現(xiàn)，靜息膜電位是番茄耐硼毒響應的一個指標，H+-ATP酶在番茄耐硼脅迫時發(fā)揮著作用[37]。Rmila等在對耐硼植物堿蒿的機制進行研究并探求與硼耐受性相關基因的表達時發(fā)現(xiàn)，當硼質(zhì)量濃度為500 mg/L（水培）時，其依然能夠正常生長，這對通過開發(fā)清潔、低成本的方案來解決硼毒問題提供了一個思路[38]。

2 轉錄組學水平的研究進展

Crick在1958年提出的中心法則認為，個體發(fā)育過程是遺傳信息由DNA傳遞到RNA最后翻譯成蛋白質(zhì)的過程，由DNA到RNA的過程稱為轉錄[39]。1997年Veclalescu等提出，轉錄組是具有生物活性的細胞所能轉錄出來的所有mRNA的總和[40]。轉錄組學是研究細胞中mRNA、rRNA、tRNA、nRNA轉錄和調(diào)控規(guī)律的學科，對功能基因組學而言非常重要。目前有很多方法被用來推測和定量轉錄組，這些方法包括基于雜交的基因芯片技術和基于測序方法的表達序列標簽技術（expression sequence tags technology，EST）、基因表達系列分析技術（serial analysis of gene expression，SAGE）、基因表達加帽分析技術（cap analysis of gene expression，CAGE）、大規(guī)模平行測序技術（massively parallel signature sequencing，MPSS）和RNA測序技術（RNA sequencing，RNA-seq）[41]。此外，隨著新一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）的快速發(fā)展，誕生了RNA-seq技術。Shendure等在分析釀酒酵母、裂殖酵母轉錄組時，首先將該技術應用于科學研究中，該技術與前幾個技術相比有巨大優(yōu)勢，如高通量、檢測范圍廣、無需特異性探針、靈敏度高等，因此該測序技術已被廣泛應用于醫(yī)學、藥物研發(fā)和農(nóng)業(yè)科學等基礎研究領域[42-46]。

Ichiro等利用擬南芥野生株、WRKY6-3轉基因植株和T-DNA插入突變體，在qRT-PCR和微陣列分析等試驗手段的幫助下，證明WRKY6基因不僅能夠增強植株抵抗病原體的攻擊和預防衰老，其在根尖表達時具有啟動子活性，轉錄表達能夠調(diào)節(jié)其他基因的表達，進而增強植株耐缺硼、硼毒的能力[47]。Quiles-Pando等利用轉錄組學的相關方法研究了擬南芥根中缺硼時硼、鈣之間的關系，結果表明，Ca2+信號相關基因的轉錄水平受缺硼影響，環(huán)核苷酸門控離子通道基因（CNGC19）表達量在缺硼6 h內(nèi)顯著上調(diào)，Ca2+轉運基因（ACA、CAX）表達量也增加;此外，鈣調(diào)素樣蛋白（CMLS）的基因和鈣依賴性蛋白激酶（CPKs）也出現(xiàn)過表達，這是第1次通過試驗發(fā)現(xiàn)細胞液內(nèi)Ca2+及Ca2+通道/轉運蛋白基因與擬南芥根系短期B缺乏相關，這為以后在基因水平上研究硼鈣之間的關系提供了理論支持[48]。Yang等通過對BD3（缺硼）和CK3（對照）進行柑橘缺硼導致葉脈木栓化時的miRNA分析，共鑒定出99種已知miRNAs和22種新miRNAs序列，結合相應數(shù)字基因表達數(shù)據(jù)，認為csi-miR156b和csi-miR164基因的表達量下調(diào)是導致它們的靶向基因SPLs、CUC2上調(diào)的原因，進而導致老葉葉脈細胞分裂并向無序階段過渡[49]。其后又對缺硼條件下紐荷爾臍橙嫁接在不同砧木的轉錄組學進行分析，發(fā)現(xiàn)參與葉綠素分解基因（CsCLH）、葡萄糖的合成基因（CsSIP、CsCWINV、CsTREH、CsTPS）、類胡蘿卜素合成基因（CsCrtR-b、CsCrtL-e）、木質(zhì)素合成基因（CsPAL、CsPOD、CsCAD）等表達的差異都非常顯著，說明這些基因與臍橙應對缺硼脅迫有關[50]。Tom buloglu對硼毒脅迫下的大麥進行高通量RNA測序，獲得了2.08億個可讀片段，根據(jù)Blast和數(shù)字基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)在根、葉組織中有16%～17%的轉錄產(chǎn)物是差異表達的，這些轉錄產(chǎn)物大多數(shù)與細胞壁、膜、蛋白激酶的形成及脅迫反應、轉運機制有關[51]。例如在根組織中檢測到磷脂酶、二價重金屬陽離子轉運蛋白和鈣調(diào)素/鈣結合蛋白（Ca2+-CAM）基因是高度表達的。此外，幾丁質(zhì)結合凝集素前體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AFC2）基因和泛素羧基末端水解酶基因表達有差異，表明這些物質(zhì)可能參與硼毒的脅迫響應，從而為在轉錄水平對植物耐硼毒的機制進行研究拓寬了思路。

3 蛋白質(zhì)組學水平的研究進展

蛋白質(zhì)組學是研究一個基因組（genome）或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)的科學，此概念最先由Wilkins等提出[52]。植物體的蛋白質(zhì)組會隨著組織甚至環(huán)境狀態(tài)的變化而變化。蛋白質(zhì)組學的主要研究范圍包括植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達水平、翻譯后修飾、蛋白之間相互作用等的科學，從而為了解疾病發(fā)生、細胞代謝等在蛋白質(zhì)水平上的變化差異而提供全面的認識。蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容主要包括3個方面：大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾、差異蛋白質(zhì)組學在疾病診斷中的應用、蛋白質(zhì)之間的相互作用[53]。

蛋白質(zhì)組學研究的一般步驟包括樣品制備[激光捕獲微解剖（LCM）、流式細胞術（FCM）]、分離純化[二維凝膠電泳技術（2-DE）、相差凝膠電泳技術（DIGE）、高效液相色譜技術（HPLC）]、分析鑒定[質(zhì)譜技術（MS）、同位素親和標記技術（ICAT）、蛋白質(zhì)芯片技術等]和肽質(zhì)量指紋譜或純蛋白質(zhì)裂解離子譜圖數(shù)據(jù)庫的檢索。質(zhì)譜技術主要包括電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸-電離飛行時間質(zhì)譜（MALD I-TOF/MS）及表面增強激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF/MS）等[54]。隨著蛋白質(zhì)組學研究的不斷發(fā)展和進步，結合生物信息學等其他技術手段在植物應對生物逆境及非生物逆境條件下的蛋白質(zhì)表達、選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種等方面都發(fā)揮著積極作用[55]。

Yang等利用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）蛋白質(zhì)表達譜分析技術研究了長期缺硼條件下柑橘根的響應機制，在缺硼、正常硼條件下用iTRAQ分析來比較蛋白質(zhì)的豐度，在缺硼植株中共鑒別出164種上調(diào)蛋白和225種下調(diào)蛋白，在根部，這些對缺硼條件適應性響應的蛋白在抑制根呼吸、清除活性氧和增強細胞的轉運能力等方面都發(fā)揮著積極作用[56]。相關研究結果表明，當柑橘根系缺硼時，蛋白質(zhì)水平顯著變化，這可能有助于缺硼植物的生存，該試驗是迄今為止針對缺硼柑橘植株蛋白質(zhì)變化的最全面的分析。其后，研究者利用二維凝膠電泳技術和質(zhì)譜分析等手段研究了耐硼柑橘品種血柑和不耐硼品種酸柚在硼毒脅迫下葉片蛋白質(zhì)的表達差異，分別發(fā)現(xiàn)50、45種蛋白質(zhì)超量表達，在蛋白質(zhì)水平揭示了2個品種的不同耐硼毒能力，為我們在翻譯水平探究柑橘的耐硼毒機制提供了新思路[57]。此外，Sasmita等通過對擬南芥葉片在缺硼、硼毒條件下的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)了硼脅迫對植株光合作用、碳水化合物代謝和蛋白質(zhì)合成的影響，并利用二維凝膠電泳技術、質(zhì)譜（MS）分析、一維凝膠電泳、免疫印記等技術手段發(fā)現(xiàn)了9種葉綠體蛋白、6種光合相關蛋白、6種脅迫相關蛋白、3種蛋白合成相關蛋白的響應性表達，這些響應蛋白大部分（8種）表達下調(diào)，只有3種蛋白的表達是增加的，最終的研究結果表明，硼脅迫在葉綠體和蛋白質(zhì)合成的初期有顯著影響，但對氧化應激蛋白合成無顯著影響[58]。Wang等利用蛋白質(zhì)組學的方法揭示了短期缺硼條件下甘藍型油菜的適應性機制，利用MALD I-TOF/MS鑒別出46種具有表達差異的蛋白，結合實時熒光定量PCR（qPCR）及其他相關技術研究發(fā)現(xiàn)，碳通量可能是一個應對硼脅迫的調(diào)制過程，穩(wěn)定的細胞壁結構、抗氧化系統(tǒng)的作用和復雜的信號網(wǎng)絡可能有助于對硼缺乏的耐受[59]。Alves等對白羽扇豆根系蛋白質(zhì)組進行分析，利用二維電泳方法在根中共發(fā)現(xiàn)406個多肽，發(fā)現(xiàn)有265個多肽對硼缺乏應答[60]。利用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，其中128種響應多肽與細胞壁代謝、細胞結構、防御、能量代謝和蛋白質(zhì)代謝有關，通過檢測細胞骨架合成相關蛋白的變化可知，長期缺硼是導致細胞骨架改變的重要因素之一。

4 代謝組學水平的研究進展

代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后的一門新興組學學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成。代謝組學技術是對特定生理時期內(nèi)某一生物或細胞所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性、定量分析的一門新學科，這些代謝物一般是維持細胞正常代謝和生理功能所必需的[61]。代謝組學研究的物質(zhì)原子排列與蛋白質(zhì)組（20個氨基酸的排列）和轉錄組（4個堿基與糖和磷酸骨架結合的排列）相比有很大不同，這導致它們之間的化學性質(zhì)（分子量、極性、溶解度）和物理（波動）性質(zhì)有很大不同，因此對其研究有獨特意義[62]。根據(jù)不同研究目的，代謝組學又可分為靶標與非靶標代謝組學。近年來，代謝組學的發(fā)展朝著標準化、定量化與一體化的方向發(fā)展，但是由于非靶標代謝組學存在一些缺點，例如只能對代謝物進行定性或半定量測定，已無法滿足現(xiàn)在的研究需求，故靶標代謝組學已經(jīng)成為代謝組學的發(fā)展趨勢[63]。

代謝組學的研究過程包括數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)分析等步驟，由于每個步驟的目的不同，采用的技術也不盡相同。采集生物樣品后，需要先經(jīng)生物反應預處理，采用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜聯(lián)用如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等技術獲得代謝譜或代謝指紋譜，然后使用KEGG、Metlin和HMDB等數(shù)據(jù)庫用于代謝物生物功能的解釋和代謝通路分析，用SPSS、Origin等軟件比較數(shù)據(jù)間的差異[64]。根據(jù)不同試驗目的，需要選用不同的試驗技術，詳見表1。

目前， 植物中的代謝物已經(jīng)超過20萬種，包括糖類、蛋白質(zhì)和脂肪等初生代謝產(chǎn)物及類帖、酚類和含氮堿基等次生代謝物，所以對植物代謝物進行分析是非常必要的[71]。近年來，硼這一植物必需元素與植物之間的關系在代謝水平上的研究也逐漸展開。

劉亞林等綜述了植物中硼、鈣2種元素在細胞壁中相互作用機制的研究進展，并提出了利用代謝組學等技術手段構建兩者的代謝通路，找到共調(diào)解通路或者物質(zhì)[72]。Roessner等利用代謝組學方法研究耐硼型大麥（Sahara）和不耐硼型大麥（Clipper）在高硼條件下的代謝物變化，通過對根部、葉部代謝譜圖的分析發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸、奎寧酸等物質(zhì)的代謝水平與對照相比差異非常顯著，這項試驗結果說明了2個基因型不同的大麥品種的代謝信息差異及它們對硼的代謝響應機制[73]。Marta等在探究缺硼條件下羽扇豆的代謝情況時發(fā)現(xiàn)，缺硼對糖代謝的影響較小，而對游離氨基酸含量的影響較大，如天冬氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸等逆境響應或信號傳遞相關物質(zhì)含量增加，而甘氨酸含量則下降[74]。Liu等利用代謝輪廓分析揭示了缺硼導致臍橙植物中心代謝模式的改變，發(fā)現(xiàn)硼缺乏葉中積累的物質(zhì)主要有脯氨酸、L-鳥氨酸、肌醇和異肌醇等，而與三羧酸循環(huán)相關的檸檬酸、琥珀酸、草酸等物質(zhì)的積累則減少，根、葉中的淀粉積累量都增多，這些結果表明，中心代謝模式的改變可能是對臍橙硼缺乏的特定適應性反應[75]。Dong等研究了柑橘砧木的根和葉對缺硼的不同代謝響應，發(fā)現(xiàn)葉片可溶性糖的積累導致磷酸戊糖途徑和氨基酸的生物合成下降、根部游離氨基酸增多導致蛋白質(zhì)合成減弱、莽草酸途徑的產(chǎn)物發(fā)生改變導致根畸形，這些都是對硼缺乏的響應，試驗結果全面揭示了硼缺乏時根和葉的差異性代謝響應及缺硼癥狀與代謝物的關系[76]。

5 展望

隨著組學技術的不斷發(fā)展，其應用于生命科學研究的進程也不斷加快，組學技術給我們解釋生命的本質(zhì)提供了可能，但其應用還存在一些不足：（1）檢測費用昂貴、步驟繁瑣、精度不高等問題制約了組學技術的發(fā)展與應用。（2）數(shù)據(jù)處理難度大。由于組學技術是高通量檢測，得到大量原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析和挖掘方法比較缺乏。（3）由于單一組學只著眼于生命現(xiàn)象的一部分，不能完全解釋某一生命現(xiàn)象，或不能更清楚地揭示現(xiàn)象的本質(zhì)。

根據(jù)以上問題，著重開發(fā)通用性好、靈敏度高、速度快、實用性強的組學分析儀器，開發(fā)更多的數(shù)據(jù)處理軟件，建立數(shù)學模型和方法，將2種或2種以上不同的組學技術有機結合并與脂類組學、糖組學等新興組學結合，同時結合生物信息學、數(shù)學建模和建立數(shù)據(jù)庫等方法，可以更加系統(tǒng)、深入、精確地探究植物的基因調(diào)控和相關信號傳遞網(wǎng)絡系統(tǒng)的機制和硼脅迫對其影響的潛在機制，從而為品種改良、抗逆境脅迫等方面的研究提供理論支持。

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