新生SD大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的比較

王鳳閣，孫思琪，韓 月，孔鈺琳，張緒東

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

原代心肌細(xì)胞是探究心血管疾病發(fā)病機(jī)制以及研制有效新藥的重要工具，體外原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞可以排除神經(jīng)、體液等因素的干擾[1]，通過對(duì)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究有助于更好地了解心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期[2]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]和基因調(diào)控[4]。目前常用的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法有單一的胰酶消化法和兩種酶先后消化的胰酶+Ⅱ型膠原酶法，本研究對(duì)這兩種原代培養(yǎng)的方法進(jìn)行比較，并改用兩次90 min差速貼壁的方法提高純度，以期為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的SD乳鼠(清潔級(jí)，由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心提供)。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶、DAPI購(gòu)于Beyotime公司；Ⅱ型膠原酶、多聚甲醛購(gòu)自Biosharp公司；兔抗大鼠肌鈣蛋白I多克隆抗體購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、山羊封閉血清購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TritonX-100、PBS購(gòu)自Solarbio公司，D-hank’s購(gòu)自Biotopped公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 24 h內(nèi)新生SD乳鼠10只，雌雄不拘，隨機(jī)分為兩組，胰酶法組和胰酶+Ⅱ型膠原酶法，每組5只。異氟烷麻醉成功后，超凈臺(tái)中75%酒精浸洗消毒，開胸取心臟。在4 ℃預(yù)冷的D-hank’s溶液中剔除結(jié)締組織，剪取心室心尖部，輕輕擠出血液，充分洗滌3次，置于離心管內(nèi)待消化。

胰酶法組：采用胰酶法處理。將每個(gè)心尖組織剪碎至1 mm3，加入2 mL 37 ℃ 預(yù)熱的0.25%胰酶，置于37 ℃的電熱恒溫震蕩水槽內(nèi)消化，速度55次/min，消化6 min，取出后使用巴氏管輕柔吹打1 min后，待組織沉淀后收集消化液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，并與等量的完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)混合終止消化，放置在冰盒上。按照上述步驟消化數(shù)次至心肌組織消化完全。

胰酶+Ⅱ型膠原酶法組：采用胰酶+Ⅱ型膠原酶法處理。心尖組織無需剪碎，直接加入4 ℃預(yù)冷的0.125%胰酶，充分混勻。將離心管置于4 ℃搖床，速度50次/min，消化10 h后，取出棄掉胰酶，加入4 mL 37 ℃預(yù)熱的0.08%Ⅱ型膠原酶，置于37 ℃的電熱恒溫震蕩水槽內(nèi)，速度75次/min，消化6 min，收集每次消化液后經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾并與等量完全培養(yǎng)基混勻。同樣按照上述步驟至心肌組織消化干凈。

分別對(duì)兩種方法的濾過液進(jìn)行離心(1000 r/min，6 min)，將沉淀的細(xì)胞在適量的完全培養(yǎng)基中重懸，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中進(jìn)行兩次90 min的差速貼壁。收集差速后的細(xì)胞懸液，加入新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層融合后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 倒置顯微鏡下觀察并定期拍照不同時(shí)間的原代心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。

1.2.3 心肌細(xì)胞獲得率和存活率的測(cè)定 兩次差速貼壁后，取適量心肌細(xì)胞懸液，與等量臺(tái)盼藍(lán)混勻后，在顯微鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)并計(jì)算原代心肌細(xì)胞的獲得率和存活率，死細(xì)胞胞膜受損被藍(lán)染，活細(xì)胞胞膜完整且拒染。心肌細(xì)胞獲得率=(細(xì)胞密度×懸液體積)/心臟個(gè)數(shù)，細(xì)胞存活率=未著色細(xì)胞數(shù)/(未著色細(xì)胞數(shù)+藍(lán)染細(xì)胞數(shù))×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 心肌細(xì)胞的純度鑒定 心肌細(xì)胞在爬片培養(yǎng)第3天時(shí)，棄去培養(yǎng)液，溫PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，0.3% Triton X-100室溫通透15 min，繼續(xù)用PBS清洗3次，吸水紙吸干后加入山羊血清室溫封閉15 min。吸干封閉液后采用cTnT行免疫細(xì)胞熒光染色，PBS清洗后，加入DAPI染核5 min，再次進(jìn)行3次PBS溶液的洗滌，用抗淬滅封片劑封片后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞純度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法獲得的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察及比較兩種方法獲得的心肌細(xì)胞在差速貼壁后均呈圓形或橢圓形，懸浮于培養(yǎng)基中，但在鏡下觀察到胰酶法較胰酶+Ⅱ型膠原酶法分離獲得的心肌細(xì)胞中細(xì)胞碎片較多，即死細(xì)胞較多；培養(yǎng)至24 h后兩種方法獲得的心肌細(xì)胞基本全部貼壁，多呈梭形或多邊形，核仁清楚，單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)自律搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率不規(guī)則，此時(shí)在顯微鏡下可以明顯觀察到胰酶+Ⅱ型膠原酶法相比于胰酶法獲得更多貼壁的心肌細(xì)胞；48 h后心肌細(xì)胞已完全貼壁生長(zhǎng)，伸出偽足，折光性強(qiáng)，呈梭形和不規(guī)則形；繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，兩種方法獲得的心肌細(xì)胞聚集成片成簇，同步收縮，節(jié)律不規(guī)則，搏動(dòng)頻率40～110次/min，這與其他學(xué)者培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相似[5-6]。綜上所述，兩種方法得到的細(xì)胞都具有典型的心肌細(xì)胞形態(tài)，在形態(tài)學(xué)上無明顯的差異，但在細(xì)胞產(chǎn)量方面，胰酶+Ⅱ型膠原酶法獲得的貼壁細(xì)胞更多，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察兩種方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

2.2 兩種方法分離得到心肌細(xì)胞的獲得率和存活率的比較胰酶+Ⅱ型膠原酶法分離的心肌細(xì)胞獲得率為(1.21±0.03)×106，明顯高于胰酶法(0.65±0.02)×106；胰酶+Ⅱ型膠原酶法獲得的心肌細(xì)胞存活率(93.37±0.40)%明顯高于胰酶法(86.40±0.36)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，故在心肌細(xì)胞獲得率和存活率方面，胰酶+Ⅱ型膠原酶法優(yōu)于胰酶法。

2.3 兩次差速貼壁后心肌細(xì)胞的純度鑒定對(duì)胰酶+Ⅱ型膠原酶法和胰酶法培養(yǎng)3 d后的心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察到兩種方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的胞漿中cTnT特異性染成綠色熒光，胞核呈藍(lán)色熒光，抗cTnT抗體表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目95%以上，表明兩種方法培養(yǎng)出的心肌細(xì)胞純度無明顯差異，見圖2。

圖2 兩種方法獲得的原代心肌細(xì)胞的免疫熒光染色(×200)

2.4 兩種方法獲得心肌細(xì)胞所耗時(shí)間的比較從取心開始至獲得可接種的心肌細(xì)胞懸液為止，胰酶+Ⅱ型膠原酶法獲得的心肌細(xì)胞所耗時(shí)間(14.00±0.40)h明顯多于胰酶法(4.59±0.10)h(P<0.01)。

3 討論

心血管疾病的相關(guān)研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞加以各種創(chuàng)新技術(shù)的使用，如流式細(xì)胞儀，膜片鉗，原子力顯微鏡等[7]來進(jìn)行體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)，使其更加快捷高效，且排除了內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的影響。相對(duì)于心肌細(xì)胞系(如H9c2)而言，原代心肌細(xì)胞能更有效地反映心臟的生理功能和基因表達(dá)[8]，故保證其結(jié)構(gòu)和功能完整進(jìn)而建立理想的體外細(xì)胞模型對(duì)心血管疾病的相關(guān)研究至關(guān)重要。

在心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)過程中，選擇出生1～3 d的乳鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，出生時(shí)間越短，乳鼠心臟組織間的膠原組織含量越少，越易于消化且節(jié)省時(shí)間。消化心臟組織過程中，酶的選擇是關(guān)鍵因素，胰酶具有很強(qiáng)的消化能力，對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷較大[9]，消化時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，粘附效果不佳，活性降低[10]。故在使用胰酶法消化時(shí)需要根據(jù)心肌組織含量的多少嚴(yán)格把握好消化的力度和時(shí)間，否則容易出現(xiàn)細(xì)胞消化過度。而Ⅱ型膠原酶消化能力溫和，在消化膠原組織的同時(shí)，將心肌組織分解成單個(gè)細(xì)胞，對(duì)心肌細(xì)胞損傷小，且消化得到的心肌細(xì)胞存活率顯著提高，可以保證良好的細(xì)胞活性。故胰酶+Ⅱ型膠原酶法優(yōu)于胰酶法。

消化得到的細(xì)胞懸液中含有大量成纖維細(xì)胞，由于成纖維細(xì)胞分裂增殖的能力很強(qiáng)，利用成纖維細(xì)胞先于心肌細(xì)胞貼壁來對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)差速貼壁[11](差速貼壁一次，共90 min)的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行第二次90 min的差速貼壁，保證了心肌細(xì)胞的高純度。

在本實(shí)驗(yàn)過程中，我們從取心到獲得可接種的心肌細(xì)胞這段時(shí)間內(nèi)，與胰酶法相比，使用胰酶+Ⅱ型膠原酶法在取心后需要0.125%胰酶4 ℃過夜消化，故其實(shí)驗(yàn)所消耗的時(shí)間較長(zhǎng)。而在消化過程中，胰酶法的消化程度較強(qiáng)，吸管吹打時(shí)用力不均勻，很容易對(duì)細(xì)胞造成負(fù)面影響，操作難度增加；Ⅱ型膠原酶作用溫和，長(zhǎng)時(shí)間消化對(duì)細(xì)胞損傷不大，故胰酶+Ⅱ型膠原酶法比胰酶法更易于操作，更加高效且獲得的心肌細(xì)胞存活率更高，保證了心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了胰酶+Ⅱ型膠原酶法在兩次差速貼壁下可以高效地提取出高存活率和高純度的心肌細(xì)胞，但實(shí)驗(yàn)所消耗的時(shí)間較長(zhǎng)，可在不損傷細(xì)胞的范圍內(nèi)適度增加酶的濃度來縮短消化時(shí)間，未來很可能成為基于原代乳鼠心肌細(xì)胞研究的常用方法。