精子線粒體膜電位評估男性生育力的作用研究進(jìn)展*

錢路杰 綜述 徐惠明 審校

1.浙江省婦幼和生殖保健中心（杭州 310012）；2.杭州師范大學(xué)（杭州 311121）

全球目前約有15%的適齡夫婦無法生育，其病因中男方因素占約20%，男方因素是導(dǎo)致適齡夫婦無法生育的重要原因之一[1,2]。另外目前國內(nèi)外最新流行病學(xué)顯示男性精液質(zhì)量呈逐年下降趨勢[3]。而不明原因的少、弱、畸形精子癥，即特發(fā)性少、弱、畸形精子癥，又占據(jù)男性不育中的較大比例，因此精液質(zhì)量與男性生育力密切相關(guān)[4,5]。目前配偶妊娠與否是評價男性生育能力的金標(biāo)準(zhǔn)，而量化評價指標(biāo)主要為妊娠等待時間（time to pregnancy，TTP）及精液質(zhì)量。另外當(dāng)前評價精液質(zhì)量的主要指標(biāo)依舊為精液常規(guī)參數(shù)中的精液量、精子活力、精子形態(tài)和精子濃度等。然而我們知道精子的發(fā)生、發(fā)展及在受精的過程中受到多方面因素的影響，任何環(huán)節(jié)的異常均可能導(dǎo)致不育，因此僅憑以上指標(biāo)并不能準(zhǔn)確地反映精子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能，無法全方面評估精子狀態(tài)，故而無法全面評估男性生育能力[6,7]。近些年由于科技的發(fā)展，儀器設(shè)備的升級，分子生物學(xué)的日益更新，從微觀分子水平上研究男性不育的發(fā)病機理的學(xué)者越來越多。精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、精子內(nèi)活性氧含量（reactive oxygen species，ROS）、精子囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)、精子DNA碎片等與精子受精能力的關(guān)系日益受到關(guān)注[7,8]。

一、精子線粒體結(jié)構(gòu)與功能

線粒體是在光學(xué)顯微鏡下可見的、存在于大多數(shù)細(xì)胞中的、有兩層膜包被的細(xì)胞器，直徑約為0.5-1.0μm，是細(xì)胞中制造能量的主要場所。主要功能包括參與能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化及儲存鈣離子等，是新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵所在。另外線粒體是目前已知除細(xì)胞核外唯一一個擁有自身的遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器。Hikim A P等在研究中觀察到線粒體膜電位降低會引起線粒體膜通透性改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，在細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白酶激活因子1相結(jié)合，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteine aspartic acid specificprotease-9，caspase-9），后再激活caspase-3、6和7蛋白水解酶，水解核纖層蛋白、肌動蛋白、肌纖蛋白等，最終引起細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核呈現(xiàn)典型性的凋亡改變[9]。該研究證實了線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中扮演著重要的角色。精子線粒體作為精子活動能量來源場所，且作為唯一帶有獨立DNA的細(xì)胞器，與精子發(fā)生發(fā)展、凋亡、受精過程密切相關(guān)。

國內(nèi)外已開展精子線粒體功能與男性不育的相關(guān)性研究。目前研究證實精子受精過程所需的能量主要來自精子線粒體合成的ATP，且精子線粒體DNA與精子的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。精子線粒體的功能對精子質(zhì)量及男性生育力存在至關(guān)重要的影響。而精子MMP是評價線粒體功能的重要指標(biāo)之一。

目前精子MMP檢測常用方法：禁欲3-7天后手淫法留取精液標(biāo)本，洗滌兩次（PBS，0.01mol/L，pH 7.4），離心（300×g，5分鐘），棄上清液后PBS重懸沉淀精子，按試劑盒說明書要求調(diào)整精子濃度為1×106/ml。取50ul重懸后的精液標(biāo)本加入500ul濃度為5ug/ml的JC-1單標(biāo)試劑，充分混勻后在37℃的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育10分鐘，PBS洗滌去除多余染料后，再次重懸沉淀精子，調(diào)整精子濃度為1×106/ml，后用流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長為488nm，通過熒光通道FL1（綠）和FL2（紅）檢測熒光強度(百分率表示)，每個樣本檢測10000個精子。綠色熒光說明MMP喪失或下降，線粒體功能受損，紅色熒光說明MMP正常，線粒體功能良好。

二、精子MMP與精子質(zhì)量及男性生育力關(guān)系的研究進(jìn)展

精子MMP是指在正常精子線粒體中發(fā)生的三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的能量傳遞給電子，電子經(jīng)呼吸鏈的傳遞產(chǎn)生ATP，與此同時將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)泵至內(nèi)膜外,形成的跨膜電位差。精子MMP是評價精子線粒體功能的重要參數(shù)之一。

（一）精子MMP與精子活力、活率及生育力

Hoffman-Berling等[10]于1955年首次證明了精子尾部運動的主要能量來源是ATP。精子線粒體作為精子活動能量來源即產(chǎn)生ATP的主要場所，為精子尾部運動提供能量，與精子活力密切相關(guān)。Piasecka等[11]研究指出，精子線粒體膜電位下降與精子活力低下密切相關(guān)。而后Kasai T等[12]和Meseguer M等[13]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)精子MMP與精子活率、活力及精子受精率呈正相關(guān)。

我國董浙清等[14]對104例男性不育癥患者的精子MMP進(jìn)行檢測并進(jìn)行相關(guān)性分析，其結(jié)論與Kasai T等[12]、Meseguer M等[13]及Piasecka等[11]相符合，研究指出精子MMP和精子活率、前向運動率、側(cè)向運動率呈正相關(guān)。另外周秀芬等[15]對50例不育男性患者研究發(fā)現(xiàn)，弱精子癥不育組MMP低于正常精子不育組。同樣楊穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比,弱精子組MMP顯著降低，另外與董浙清等研究結(jié)果相一致的是MMP與精子總活力、前向運動力呈顯著正相關(guān)。白雙勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)正常不育組精子MMP率低于正常已生育組，與精子活動率呈正相關(guān)，與精子前向運動率呈正相關(guān)。吳佳學(xué)等[18]檢測精子MMP也發(fā)現(xiàn)，不育組精子MMP低于正常組，精子MMP與精子前向運動率呈顯著正相關(guān)。

精子MMP作為評價精子線粒體功能的主要指標(biāo)之一，能較好的反應(yīng)精子線粒體即產(chǎn)生ATP的功能。精子MMP的下降引起精子活力、活率下降，可能導(dǎo)致弱精子癥的發(fā)生，影響受精過程。

（二）精子MMP與精子凋亡率及精子形態(tài)

Rawe等[19]研究指出，精子尾部纖維鞘結(jié)構(gòu)異常與精子線粒體鞘數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與線粒體結(jié)構(gòu)異常呈正相關(guān)，精子線粒體影響精子尾部正常形態(tài)率。另外Piasecka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，精子活力低下與精子MMP降低密切相關(guān)，且活力低下的精子在形態(tài)上常伴隨精子中段缺乏或精子線粒體結(jié)構(gòu)異常。董浙清等[14]研究證實精子MMP與體部、尾部畸形率均具有很強的相關(guān)性，與體部畸形率、尾部畸形率呈負(fù)相關(guān)，而精子頭部異常主要是由于核染色質(zhì)異常或核膜異常而引起。另外研究結(jié)果還顯示精子MMP與精子凋亡率呈負(fù)相關(guān)，與精子濃度呈正相關(guān)。周秀芬等[15]同樣證實精子MMP喪失率與精子早期凋亡率正相關(guān)。楊穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與董浙清及周秀芬等研究結(jié)果相一致的是MMP與正常精子形態(tài)率呈顯著正相關(guān),然而與年齡、精液量、精子濃度和精子數(shù)量其余參數(shù)的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義。白雙勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)精子MMP與精子濃度呈正相關(guān)，與精子總數(shù)呈正相關(guān)。吳佳學(xué)等[18]也發(fā)現(xiàn)，精子MMP與正常精子形態(tài)率呈顯著正相關(guān)。

精子線粒體除了作為精子活動能量來源的主要場所外，是精子細(xì)胞中除細(xì)胞核外唯一帶有獨立DNA的細(xì)胞器，影響著精子細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及凋亡。精子MMP的下降引起精子凋亡率、體部畸形率、尾部畸形率的顯著上升，影響精子形態(tài)、功能，導(dǎo)致男性生育力降低。

三、精子MMP、精子質(zhì)量及男性生育力與精子ROS含量的關(guān)系探究

ROS是一大類具有化學(xué)反應(yīng)性和連鎖反應(yīng)傾向的含氧物質(zhì)、生物體有氧代謝的中間產(chǎn)物以及電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物[20]。精子內(nèi)ROS是由精子線粒體呼吸鏈的一系列氧化反應(yīng)或精子膜上的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶與其底物反應(yīng)這兩種途徑生成。

（一）精液質(zhì)量及男性生育力與精子ROS含量

目前的研究已證實，ROS會破壞生殖細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，包括線粒體DNA[21]。被ROS損傷的DNA可誘導(dǎo)生殖細(xì)胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡從而破壞正常精子數(shù)量、降低精子濃度，同時也會引起部分精子活動力的下降[22-24]。另一方面，ROS也可以直接損傷線粒體膜，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS亦可干預(yù)生精細(xì)胞的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，如可降低睪丸中抗氧化酶活性，加劇生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激；可降低能量生成相關(guān)酶活性，影響精子活動力等[25]。此外，ROS對精子結(jié)構(gòu)蛋白如鞭毛、軸絲等的損害也可降低精子活動力，增加精子畸形率，最終降低男性生育力[26]。秦欣然等[27]總結(jié)指出精子低水平ROS對于男性生殖系統(tǒng)維持正常生理功能具有重要意義，而ROS過多則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損害雄性生殖器官、導(dǎo)致性激素分泌紊亂、破壞生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能甚至改變子代的表觀遺傳，最終影響男性的生育力。

精子ROS含量過多會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，破壞鞭毛、軸絲等結(jié)構(gòu)蛋白功能，損傷線粒體膜，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞線粒體途徑的凋亡，降低精子濃度、活力，增加精子畸形率，最終影響男性生育力。

（二）精子MMP與精子ROS含量

有研究指出，ROS能破壞線粒體呼吸功能，降低精子MMP，阻礙能量生成，使得精子活動力進(jìn)一步下降[28,29]。精子ROS含量過多可損傷其線粒體DNA，通過線粒體途徑引起生殖細(xì)胞凋亡，亦可破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)、破壞線粒體呼吸功能，降低精子MMP。精子MMP的下降與精子ROS含量過多存在密切關(guān)聯(lián)[30-32]。Wang X等[33]研究指出精子內(nèi)ROS含量過高是導(dǎo)致精子MMP下降、精子細(xì)胞凋亡率升高的主要原因。

綜上所述，精子MMP與精子濃度、精子總數(shù)、精子活力、精子活率，精子體尾部畸形率、早期凋亡率、精子受精率密切相關(guān)，精子內(nèi)ROS含量過高可能是引起精子MMP下降的重要原因之一。

四、展望

目前男性不育的診斷主要依賴于常規(guī)的精液分析，包括精子濃度、活動力、形態(tài)等指標(biāo)。但是僅僅依靠這些指標(biāo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。男性不育的根本問題在于精子質(zhì)量。精子MMP的測定是對精液質(zhì)量及男性生育力評估的潛在指標(biāo)。隨著科學(xué)技術(shù)的日益更新，對于精子的發(fā)生發(fā)展過程以及其分子機制有了進(jìn)一步的了解。目前在宏觀上對于男性不育的診斷尚不全面，分子水平上微觀的研究可以在本質(zhì)上對男性不育的診斷提供重要的意義。本文就精子MMP的測定與精子質(zhì)量、精子ROS含量及男性生育力的關(guān)系做一總結(jié)與探討。然而國內(nèi)外關(guān)于精子MMP的相關(guān)研究甚少，進(jìn)一步探究精子MMP與精子內(nèi)ROS含量、精子受精率的關(guān)系，測定我國精子MMP的正常參考范圍值以及抗氧化藥物等的應(yīng)用對精子MMP的影響，對于我國男性不育的診斷及治療，對于判別我國男性是否能讓其配偶受孕的機會大小及其接受輔助生育技術(shù)成功率的可能性具有指導(dǎo)意義。