MicroRNAs作為診斷結(jié)核性腦膜炎生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

讓昕銘綜述，付 錦審校

結(jié)核是目前全球最致命的單一傳染病，結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是其最嚴(yán)重的疾病形式，引起以腦膜為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性感染性疾病。進(jìn)行抗結(jié)核化療和糖皮質(zhì)激素輔助治療后仍有幾乎一半的TBM患者死亡或遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，延誤診斷及治療被認(rèn)為是高死亡率和致殘率的主要原因。由于臨床表現(xiàn)不典型，目前TBM的診斷主要依靠腦脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)培養(yǎng)。然而，MTB培養(yǎng)敏感性僅為45%～60%，且需要2～8 w才能得到結(jié)果[1,2]。因此，為TBM尋找特異、快速而敏感的診斷標(biāo)志物具有重要價值。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是一種長度約為22個核苷酸的保守非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，在健康個體中有助于維持免疫穩(wěn)態(tài)。然而，在不同的疾病中miRNAs的表達(dá)水平有明顯的改變，其中miR-155已被確定為診斷乳腺癌的新型生物標(biāo)志物[3]，提示miRNAs可作為疾病的確診指標(biāo)。研究顯示，miRNAs在TBM發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，在TBM患者中已觀察到miRNAs譜的異常表達(dá)，但目前關(guān)于miRNAs如何參與TBM發(fā)病機(jī)制的研究十分有限。因此，本文總結(jié)了近年來有關(guān)TBM中miRNAs譜的報道，論述miRNAs作為診斷TBM生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，為其在TBM診治中的進(jìn)一步研究提供幫助。

1 TBM診斷研究進(jìn)展概述

TBM早期診斷和治療是減少致殘率和死亡率的有效手段。目前TBM診斷仍然是個臨床挑戰(zhàn)，主要依據(jù)微生物學(xué)和分子學(xué)檢測診斷。長期以來，TBM的微生物診斷手段主要集中于CSF齊爾-尼爾森(Ziehl-Neelsen,Z-N)染色和MTB培養(yǎng)，但這兩種方法在臨床應(yīng)用上都受到CSF細(xì)菌載量低的阻礙。CSF涂片敏感性很低，對于高細(xì)菌負(fù)荷相關(guān)的結(jié)核病可達(dá)50%，TBM等少菌性疾病的敏感性僅為10%～20%。MTB培養(yǎng)顯示出相對較高的敏感性(45%～60%)，但其培養(yǎng)周期較長，在固體培養(yǎng)基上耗時長達(dá)8 w，在液體培養(yǎng)基上也至少需要10 d，限制了其在臨床工作中的應(yīng)用價值[1,2]。盡管已在液體培養(yǎng)基中開發(fā)出檢測MTB的新方法-顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)(microscopic observation of drug susceptibility,MODS)，但目前幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，其培養(yǎng)時長也需要1 w左右，仍然無法實(shí)現(xiàn)早期診斷[4]。由于微生物診斷敏感性低，耗時長，常導(dǎo)致延遲治療，推動了基于核酸擴(kuò)增的分子學(xué)檢測的發(fā)展，分子結(jié)核病快速診斷領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展。

Xpert MTB/RIF(Xpert)是一種基于實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)的分子學(xué)診斷方法，不僅可以檢測MTB，還可以檢測與利福平耐藥性相關(guān)的突變，已被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦用于TBM的早期診斷試驗(yàn)。然而，目前3項(xiàng)探討Xpert對TBM診斷作用的研究表明，該檢測方法對TBM的靈敏度從59%～80%不等，受所測CSF容量、檢測前是否離心以及診斷金標(biāo)準(zhǔn)選擇等因素的影響較大，且陰性預(yù)測值較低(78.8%)，可能導(dǎo)致漏診及死亡，無法成為TBM的單一檢測方法[5～7]。第二代檢測手段，Xpert MTB/RIF Ultra(Xpert Ultra)最近已被開發(fā)出來，其對TBM診斷的靈敏度相較Xpert提高了25%，尤其表現(xiàn)在CSF涂片和MTB培養(yǎng)敏感性較低的部位，2017年已被WHO推薦成為Xpert的替代品。然而，Xpert Ultra的陰性預(yù)測值仍然過低(76.4%)，無法作為TBM的排除標(biāo)準(zhǔn)[7]。另外，γ-干擾素釋放試驗(yàn)、CSF中腺苷脫氨酶檢測及影像學(xué)手段也可用于TBM的診斷，但均因靈敏度及特異性不足，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)異質(zhì)性而無法廣泛應(yīng)用于臨床，為TBM找到特異、快速且高效的診斷標(biāo)志物迫在眉睫。

2 miRNAs的產(chǎn)生及生物學(xué)作用

顧名思義，miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，其中大多數(shù)在不同物種之間高度保守。人類基因組共編碼超過2000個miRNAs，其生物發(fā)生通常始于由RNA聚合酶(Pol)Ⅱ或RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成的初級轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNAs)。這些pri-miRNAs的長度有時甚至超過1000個核苷酸，具有5’帽子結(jié)構(gòu)和3’多聚腺苷酸化尾，可由RNA酶III核酸內(nèi)切酶Drosha進(jìn)一步加工形成約70個核苷酸長的前體miRNAs(pre-miRNAs)。隨后，pre-miRNAs借助輸出蛋白5(Exportin-5)及其輔助因子Ran-GTP從核內(nèi)穿梭進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)被Dicer酶識別并修剪成為長約22個核苷酸的成熟miRNAs。成熟miRNAs與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合形成miRISC，進(jìn)而與靶mRNAs的3’非翻譯區(qū)結(jié)合導(dǎo)致其翻譯受阻或降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)[8]。

研究表明，單個miRNA可以靶向作用于多個mRNAs，一個mRNA也可以被幾種不同的miRNAs靶向調(diào)控，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。據(jù)估計，miRNAs可調(diào)控超過50%的細(xì)胞mRNAs，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、機(jī)體發(fā)育和維持生理功能等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。不僅如此，miRNAs的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-141在前列腺癌患者血清中表現(xiàn)出最顯著的差異表達(dá)(46倍過表達(dá))，能以60%的敏感性和100%的特異性區(qū)分前列腺癌患者和健康對照組[10]，而miR-326是一種在腫瘤和自身免疫病中具有功能相關(guān)性的關(guān)鍵miRNA，可作為導(dǎo)管腺癌、肝細(xì)胞癌及多發(fā)性硬化等多種疾病的診斷標(biāo)志物[11]。由此可見，miRNAs在疾病診斷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景，可能是多種疾病潛在的生物標(biāo)志物。近年研究表明，miRNAs參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對病原體的免疫應(yīng)答，是MTB逃避免疫攻擊的重要效應(yīng)因子[12]，這一發(fā)現(xiàn)為miRNAs作為診斷結(jié)核病等傳染性疾病的生物標(biāo)志物提供可能。

3 miRNAs是診斷結(jié)核病的生物標(biāo)志物

3.1 血液中miRNAs是診斷結(jié)核病的生物標(biāo)志物 隨著近些年來轉(zhuǎn)錄組學(xué)的不斷發(fā)展，miRNAs測序篩選及實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)驗(yàn)證已成為目前的主流研究手段。2013年的兩項(xiàng)針對血清的研究表明，6種(miR-378、miR-483-5p、miR-22、miR-29c、miR-101和miR-320b)和15種(let-7e、miR-146a、miR-148a、miR-16、miR-192、miR-193a-5p、miR-25、miR-365、miR-451、miR-532-5p、miR-590-5p、miR-660、miR-885-5p、miR-223*和miR-30e)miRNAs組合具有巨大潛力，可作為鑒別肺結(jié)核患者和健康對照的生物標(biāo)志物[13,14]。Latorre等對9名活動性肺結(jié)核患者、10名潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)患者及6名健康組進(jìn)行全血miRNAs測序及RT-qPCR驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，miR-150、miR-21、miR-29c和miR-194是區(qū)分活動性肺結(jié)核的重要分子[15]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，將活動性肺結(jié)核患者與LTBI及健康對照比較時，這4種miRNAs組合表現(xiàn)出顯著的特異性(87.95%)及靈敏度(91.21%)。驚喜的是，上述4種miRNAs之前均被證實(shí)是免疫調(diào)控的重要分子，可為MTB的存活和增殖創(chuàng)造免疫學(xué)上有利的環(huán)境，故可作為結(jié)核病快速診斷的生物標(biāo)志物。此外，Ndzi等利用RT-qPCR及受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析證明，另一miR-29家族成員，miR-29a-3p，在區(qū)分活動性結(jié)核患者與LTBI(84.35%)及健康對照(81.37%)時均具有良好的診斷性能，還可用于監(jiān)測抗結(jié)核治療的療效，是結(jié)核病診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物[16]。

3.2 細(xì)胞中miRNAs是診斷結(jié)核病的生物標(biāo)志物 當(dāng)前研究表明，結(jié)核是由MTB誘導(dǎo)的機(jī)體抵抗力降低或細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)引起的，巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞是機(jī)體抗結(jié)核免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞。Liu等在活動性結(jié)核患者的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、單核細(xì)胞及單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中觀察到miR-223表達(dá)的升高，并證實(shí)其可通過抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活化調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能[17]。Huang等證明miR-155在活動性結(jié)核患者的PBMC及卡介苗感染的THP-1人單核細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)，并可通過調(diào)節(jié)叉頭框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)的表達(dá)抑制單核細(xì)胞凋亡，有助于結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展[18]。此外，在體外感染MTB的RAW264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)以及體內(nèi)感染MTB的小鼠的肺中均觀察到miR-155表達(dá)的上調(diào)[19]。一項(xiàng)針對CD4+T細(xì)胞的研究表明，27個miRNAs在活動性結(jié)核患者、LTBI及健康對照組間差異表達(dá)，其中miR-29水平與γ-干擾素mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明miR-29是抗結(jié)核免疫反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子，可能是診斷結(jié)核病的潛在生物標(biāo)志物[20]。

4 miRNAs是診斷TBM的生物標(biāo)志物

4.1 血液中miRNAs是診斷TBM的生物標(biāo)志物 Chai等采用RT-qPCR方法檢測了20例TBM及20例原發(fā)性頭痛患者血漿中miR-125b、miR-29a及miR-155-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)3種miRNAs在TBM患者中的表達(dá)水平顯著升高[21]。Yuan等發(fā)現(xiàn)除上述3種miRNAs外，miRNA-3179a及miRNA-144在TBM患者血漿中的表達(dá)水平也顯著高于對照組[22]，進(jìn)一步擴(kuò)大了TBM中異常miRNAs譜。一項(xiàng)關(guān)于血漿外泌體miRNAs的研究表明，6種外泌體miRNAs(miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191和miR-486)在結(jié)核病患者(肺結(jié)核及TBM)中表達(dá)上調(diào)。ROC曲線分析確定，TBM組與non-TBM組相比，曲線下面積(Area Under the Curve,AUC)高達(dá)0.97，與健康對照相比，AUC可達(dá)0.86。并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2個月的抗結(jié)核治療后，上調(diào)miRNAs的表達(dá)呈下降趨勢，表明此6種外泌體miRNAs可能是TBM臨床診斷及治療的生物標(biāo)志物[23]。

4.2 細(xì)胞及CSF中miRNAs是診斷TBM的生物標(biāo)志物 先前研究已表明，miR-29家族(miR-29a、miR-29b和miR-29c)是結(jié)核病發(fā)病過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Pan等采用RT-qPCR分析檢測miR-29a在112名TBM兒童和130名健康兒童PBMC及CSF中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，TBM患兒PBMC和CSF中miR-29a的表達(dá)升高。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，PBMC和CSF中miR-29a水平與顱內(nèi)高壓、意識障礙、腦膜刺激及腦外結(jié)核等表現(xiàn)均相關(guān)。ROC分析曲線顯示miR-29a在PBMC、CSF及PBMC與CSF的組合中，均在區(qū)分TBM與健康組時表現(xiàn)出較好的敏感度和特異度[24]，這一結(jié)果表明PBMC和CSF中的miR-29a可能是診斷小兒TBM的生物標(biāo)志物。另有兩項(xiàng)關(guān)于TBM及原發(fā)性頭痛患者的研究表明，TBM患者CSF中miR-29a的表達(dá)水平明顯升高[21,22]。結(jié)核病中的另一重要效應(yīng)分子，miR-155，也被驗(yàn)證在TBM患者的CSF中表達(dá)上調(diào)，可以成為診斷TBM的生物學(xué)標(biāo)志物[22,25]。不僅如此，let-7家族的兩個成員，let-7d與let-7b也被發(fā)現(xiàn)是診斷TBM的潛在工具，相對于健康對照組，兩者在TBM患者CSF外泌體中的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，而let-7d同時可以鑒別TBM與病毒性腦膜炎(viral meningitis,VM)[26,27]。另一項(xiàng)針對TBM與VM的研究表明，6個miRNAs在TBM與VM，TBM與健康對照組的PBMC中差異表達(dá)。并進(jìn)一步通過獨(dú)立PBMC樣本集(32例TBM、30例VM和34例健康對照)證實(shí)，4種miRNAs(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p)在TBM中的異常表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中miR-126-3p、miR-130a-3p和miR-151a-3p在CSF樣本中(36例TBM和34例VM)也表現(xiàn)出顯著差異。ROC分析表明，PBMC中這4種miRNAs可將TBM與VM區(qū)分，AUC值均大于0.7，并發(fā)現(xiàn)這4種miRNAs的組合可以實(shí)現(xiàn)更好的區(qū)分能力(AUC=0.893)，可作為TBM與VM鑒別診斷的生物標(biāo)志物[28]。

5 結(jié) 語

TBM是最嚴(yán)重的結(jié)核病形式，致死致殘率高，亟需找到敏感、簡便且特異的診斷標(biāo)志物。目前研究已表明，miRNAs是TBM發(fā)生發(fā)展中的重要效應(yīng)分子，在TBM的血液、CSF及免疫細(xì)胞中均可見miRNAs譜的異常表達(dá)，并已闡明了部分miRNAs在TBM中的作用靶點(diǎn)，挖掘了TBM發(fā)病過程中可能的分子機(jī)制。多項(xiàng)研究已證明miR-29及miR-155是TBM中有希望的診斷標(biāo)志物，但其在其他疾病中同樣表達(dá)異常，臨床應(yīng)用價值有限。我們發(fā)現(xiàn)miRNAs組合在TBM中的診斷潛力更大，血漿外泌體6種miRNAs(miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191和miR-486)及PBMC中4種miRNAs(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p)組合均在TBM的診療方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，目前關(guān)于miRNAs對TBM作用的研究有限，未來還需進(jìn)一步研究，鑒定在TBM發(fā)病過程中敏感而特異的miRNAs作為診斷標(biāo)志物，為TBM的臨床診斷及治療靶點(diǎn)提供指導(dǎo)意義。