修復(fù)骨缺損的脂肪干細(xì)胞組織工程材料的研究進(jìn)展

趙 鵬, 黃 東, 熊雅茹, 劉曉春, 牟 勇, 孫大煒

(1.南華大學(xué)，湖南省衡陽市 421001；2.唐山開灤總醫(yī)院骨科，河北省唐山市 063000；3.廣東省第二人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東省廣州市 510000；4.廣東省第二人民醫(yī)院麻醉科，廣東省廣州市 510000)

骨缺損是骨科常見的疾病之一。少量的骨質(zhì)缺損可通過自身骨再生作用進(jìn)行修復(fù)，然而當(dāng)骨缺損達(dá)到骨干缺損的1.5倍時(shí)，便超出機(jī)體的愈合能力。傳統(tǒng)治療骨缺損的方式包括自體骨移植、骨誘導(dǎo)膜技術(shù)等，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖有一定成效，但總體治療效果不佳。骨組織工程支架的發(fā)展，為骨缺損疾病的治療提供新的治療方法。用于骨缺損治療的骨組織工程支架，其主要由兩部分構(gòu)成，即具有骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)特性的3D生物材料支架以及各類成骨誘導(dǎo)因子或“種子”細(xì)胞。目前常用的也是研究最為深入的“種子”細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，但BMSCs因其獲取困難，數(shù)量較少，其應(yīng)用受到限制。

自2001年Zuk等[1]證實(shí)脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有與BMSCs高度相似的全能分化特性以來，對(duì)于ADSCs在骨組織工程支架應(yīng)用的研究逐漸增多。進(jìn)而出現(xiàn)許多新型骨組織工程支架，其中包括由單純ADSCs構(gòu)成的骨組織工程支架、各類藥物或生長(zhǎng)因子聯(lián)合ADSCs構(gòu)成的骨組織工程支架、基因修飾的ADSCs構(gòu)成的骨組織工程支架。這些生物工程支架在骨缺損修復(fù)各有優(yōu)勢(shì)及不足，但目前尚無文章對(duì)這些骨組織工程支架進(jìn)行總結(jié)。

1 ADSCs在組織工程支架構(gòu)建研究中的發(fā)展

1.1 單純ADSCs復(fù)合生物支架

自ADSCs的全能分化特性被發(fā)現(xiàn)以來，絕大多數(shù)的研究仍停留在細(xì)胞學(xué)及動(dòng)物學(xué)層面，而用于解決臨床疾病治療的研究報(bào)道卻極少。王之發(fā)等[2]放棄傳統(tǒng)支架，將ADSCs移植于成骨性細(xì)胞膜片上使骨缺損得到良好修復(fù)。王闖健等[3]將ADSCs在特定培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)后與噴墨全包芯骨支架復(fù)合，并移植于兔股骨骨缺損處，術(shù)后第12、24、48周發(fā)現(xiàn)，ADSCs骨支架移植組骨缺損區(qū)修復(fù)面積遠(yuǎn)大于未加入ADSCs的移植組。黃健萍等[4]利用殼聚糖支架復(fù)合ADSCs，將其移植于鼠顱骨骨缺損模型，同樣證實(shí)ADSCs的促進(jìn)骨修復(fù)作用。目前，已證實(shí)可與ADSCs復(fù)合并對(duì)骨缺損修復(fù)具有促進(jìn)作用的支架除傳統(tǒng)的脫鈣骨、β-磷酸三鈣支架以外，還包括如明膠海綿、納米膠原骨材料支架、纖維蛋白膠、生物性玻璃以及含鍶離子支架Sr10-HA-PBLG等新型材料。

通過改變不同生物工程支架為ADSCs提供成骨誘導(dǎo)環(huán)境，減弱ADSCs的成脂作用，提高其成骨特性，使ADSCs在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的作用得以肯定。單純依靠生物工程支架所提供的成骨微環(huán)境不能使ADSCs成骨分化作用穩(wěn)定維持。

1.2 藥物、生長(zhǎng)因子等聯(lián)合ADSCs生物骨支架

1.2.1 中藥提取物 中成藥物研究的發(fā)展，為骨組織工程支架提供新的思路，Ding等[5]、劉寧等[6]兩位學(xué)者分別利用續(xù)斷、皂苷Ⅵ、淫羊藿苷與ADSCs復(fù)合后種植于無機(jī)物支架，并在動(dòng)物骨缺損模型中收到良好治療效果。但中成藥成分復(fù)雜，局部的應(yīng)用是否對(duì)機(jī)體造成影響，并未有相關(guān)報(bào)道。

1.2.2 生長(zhǎng)因子 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前成骨作用最強(qiáng)的一類生長(zhǎng)因子，為TGF-β超家族的一員，能上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟。研究顯示，不同濃度的BMP會(huì)對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的效果，低濃度BMP能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向骨組織形成區(qū)移行，中等濃度BMP可促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨及成骨細(xì)胞方向分化，而高濃度BMP能促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的增生。丁濤等[7]將BMP-14與ADSCs共同復(fù)合于羥基磷灰石/絲素蛋白上，而后移植于大鼠尾骨骨缺損模型，使大鼠尾骨骨缺損處得以良好愈合。但BMP對(duì)ADSCs復(fù)合材料的實(shí)驗(yàn)研究更多的是軟骨修復(fù)方向，而骨缺損修復(fù)的相關(guān)研究相對(duì)較少，且大多處于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)層面。

1.2.3 富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRP) PRP這一概念最早由Hood等于1993年首先提出，是含有血小板超過生理水平至少4倍的血漿，其組成成分復(fù)雜，主要修復(fù)機(jī)制為釋放生長(zhǎng)因子PDGF和TGF-β以促進(jìn)組織的修復(fù)再生。根據(jù)所含白細(xì)胞的多少，PRP可分為貧白細(xì)胞PRP和富白細(xì)胞PRP兩種，相對(duì)于貧白細(xì)胞PRP而言，富白細(xì)胞PRP可能有更好抗炎作用，因?yàn)榘准?xì)胞釋放出的遞質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)多種細(xì)胞聚集和黏附以利于修復(fù)作用。目前為止，PRP的制備方法無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，其制備主要有密度梯度離心法、血漿分離置換法兩種方式。密度梯度離心法是根據(jù)血液中各組分沉降系數(shù)的不同，在全血加入抗凝劑后進(jìn)行低轉(zhuǎn)速離心使全血分為四層，此方法得到的為貧白細(xì)胞PRP，此種方法由Anitua發(fā)明。而現(xiàn)在所用的多為二次離心，即在第一次離心后將血液分成3層，取交界處的一層進(jìn)行二次離心，最終獲得的為富白細(xì)胞PRP。PRP在骨缺損修復(fù)方面具有良好療效。PRP與ADSCs共同復(fù)合骨組織工程支架治療骨缺損的研究目前較少，F(xiàn)eng等[8]將PRP與ADSCs共同復(fù)合于β-TCP支架移植于兔下頜骨缺損模型中，最終收到良好治療效果。Cruz等[9]將人脂肪干細(xì)胞、犬自體富血小板血漿凝膠支架用于修復(fù)比格犬脛骨缺損，與自體骨移植組相比，實(shí)驗(yàn)組有更多的骨形成和骨成熟。

1.2.4 化學(xué)有機(jī)物 相對(duì)于早期單純ADSCs移植而言，在ADSCs中加入其他具有促成骨分化作用的物質(zhì)，可為ADSCs的分化提供較為持久的成骨誘導(dǎo)環(huán)境，文進(jìn)等[10]利用Exendin-4與ADSCs共培養(yǎng)修復(fù)小鼠股骨骨缺損，發(fā)現(xiàn)Exendin-4能夠明顯促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨形成。趙亞杰等[11]利用氯化鈣與ADSCs共同培養(yǎng)修復(fù)大鼠骨缺損模型，同樣收到良好效果。

生長(zhǎng)因子及藥物的半衰期短，移植入動(dòng)物模型后在短時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)ADSCs的成骨分化作用，一旦生長(zhǎng)因子及藥物衰減代謝至較低水平時(shí)，其誘導(dǎo)環(huán)境便遭到破壞，且不能進(jìn)行持續(xù)添加。因此調(diào)控性較差，持續(xù)誘導(dǎo)作用仍較為短暫，以至于干細(xì)胞整體利用率較低。復(fù)合的生長(zhǎng)因子及藥物本身具有成骨誘導(dǎo)作用，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見成骨作用增加，但究竟是復(fù)合的物質(zhì)影響ADSCs成骨分化還是ADSCs的加入增強(qiáng)復(fù)合物質(zhì)的成骨促進(jìn)作用尚不明確。

1.3 基因修飾ADSCs細(xì)胞生物支架

基因工程技術(shù)的成熟，為生物骨支架的構(gòu)建提供了優(yōu)質(zhì)的“種子”細(xì)胞。Li等[12]早在2007年通過慢病毒將BMP-2轉(zhuǎn)入ADSCs中，結(jié)合β-磷酸三鈣支架，移植于犬尺骨骨缺損模型中，在術(shù)后16周，X線、組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)分析表明，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染基因的ADSCs移植組，BMP-2基因修飾的ADSCs產(chǎn)生了新形成的骨面積顯著增加，所有的骨缺損愈合。Chiarella等[13]發(fā)現(xiàn)敲除鋅指蛋白521(Zinc finger protein 521,ZNF521)可顯著促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞成骨分化，增加晚期礦化骨結(jié)節(jié)的積累。除上述基因外，目前實(shí)驗(yàn)證實(shí)的可促進(jìn)ADSCs成骨分化的基因有Cbfa-1、US2/US3、抗miR-26a-5p、rhPDGF。

相較于復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子，同樣可增加脂肪干細(xì)胞成骨分化。Yanai等[14]研究表明，在ADSCs培養(yǎng)基中添加rhBMP-2的培養(yǎng)基,可明顯提高成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞成骨分化。

2 ADSCs復(fù)合骨組織工程支架的探討

2.1 ADSCs復(fù)合骨組織工程支架應(yīng)用的可行性

ADSCs作為一類干細(xì)胞，具有良好的自我更新能力、增殖能力、全能分化能力，其遺傳穩(wěn)定性良好，實(shí)驗(yàn)證明體外傳代培養(yǎng)13～15代時(shí)可依然保持其穩(wěn)定的生物學(xué)特性，增殖能力優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[15-17]。并且ADSCs獲取途徑十分容易，通過在抽取后的脂肪組織中加入膠原酶，梯度離心酶解后脂肪懸液便可獲取。

ADSCs經(jīng)過體外誘導(dǎo)，可分化為不同類型的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。向培養(yǎng)基中加入地塞米松，可使其分化后的細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP。但研究表明，其成骨分化方向與加入的誘導(dǎo)劑濃度有關(guān)，例如，加入1 μg/L的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可誘導(dǎo)其成骨方向分化，而加入1 000 μg/L的bFGF，其成脂分化作用顯著。雖然目前對(duì)ADSCs的研究目前仍處于起步階段，但其具有獲取簡(jiǎn)單，增殖能力強(qiáng)，具有全能分化特性等優(yōu)點(diǎn)，且各種骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示其具有良好的治療效果，因此，ADSCs為骨缺損的治療提供了新的思路。

2.2 ADSCs復(fù)合骨組織工程支架的優(yōu)點(diǎn)

ADSCs復(fù)合骨組織工程支架的發(fā)展大致經(jīng)歷三個(gè)階段。第一階段為嘗試階段，單純將體外經(jīng)過成骨誘導(dǎo)分化后的ADSCs與組織工程支架相結(jié)合，并進(jìn)行動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)。第二階段為細(xì)胞學(xué)層面改良階段，將具有成骨誘導(dǎo)作用的物質(zhì)如藥物、生長(zhǎng)因子等加入到ADSCs復(fù)合骨組織工程支架中，為其提供持續(xù)的骨誘導(dǎo)環(huán)境，但骨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間仍較為短暫。第三階段，也是目前研究所處階段，即對(duì)ADSCs在基因?qū)用孢M(jìn)行改良，將具有成骨誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入ADSCs中，使其源源不斷的產(chǎn)生成骨誘導(dǎo)因子以促進(jìn)ADSCs成骨分化，但仍存在諸多問題以待解決。

在第一階段中，單純利用體外成骨誘導(dǎo)后的ADSCs，因單純的組織工程支架其成骨誘導(dǎo)作用微弱，無法為ADSCs提供持續(xù)的骨誘導(dǎo)環(huán)境，雖然對(duì)組織工程支架進(jìn)行改良，如由最初的羥基磷灰石支架再到脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架再到聚乳酸支架。但單獨(dú)依靠支架所提供的成骨微環(huán)境不足以使增殖后ADSCs持續(xù)成骨分化，勢(shì)必ADSCs成骨分化作用逐漸減弱。而利用體外物理干預(yù)如使用540 s波長(zhǎng)為660 nm的紅光照射，雖在動(dòng)物骨缺損模型中收獲可觀效果，但能否用于臨床骨缺損疾病的治療需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

相對(duì)于第一階段的單純移植，第二階段在ADSCs骨組織工程支架中加入其他成骨誘導(dǎo)因子，雖延長(zhǎng)了成骨誘導(dǎo)時(shí)間，但生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期較短，仍無法保證在骨修復(fù)全過程中對(duì)ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。中藥對(duì)疾病的治療在中國已有幾千年歷史。近年來，在ADSCs骨組織工程支架中加入中藥提取物如杜仲醇、斷續(xù)、皂苷等，并對(duì)動(dòng)物骨缺損的修復(fù)得到了樂觀的效果。但迄今為止，尚無臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)其局部應(yīng)用的生物安全性。

由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，ADSCs骨組織工程支架可以為ADSCs提供持續(xù)的成骨誘導(dǎo)環(huán)境。目前常用的病毒轉(zhuǎn)染方法有兩類，一是慢病毒轉(zhuǎn)染，另一種是腺病毒轉(zhuǎn)染。兩種轉(zhuǎn)染方式，均能高效地將目的基因轉(zhuǎn)入ADSCs中，能使目的基因持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。但兩種方法也存在一些不同，例如慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率低于腺病毒轉(zhuǎn)染，腺病毒轉(zhuǎn)染無法將目的基因重組至細(xì)胞基因組上，而慢病毒可以做到，但有可能發(fā)生重組的危險(xiǎn)。通過腺病毒及慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將已知且明確的成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)入ADSCs中，可以很好地解決外源性生長(zhǎng)因子及藥物濃度隨時(shí)間逐漸遞減問題，極大的促進(jìn)ADSCs的成骨分化作用同時(shí)也為其提供穩(wěn)定、持續(xù)的成骨誘導(dǎo)環(huán)境。雖然其具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但存在的問題未能在文章中進(jìn)行探討，如轉(zhuǎn)染后ADSCs表型如何進(jìn)行穩(wěn)定，使其保持自身的干細(xì)胞特性，何種轉(zhuǎn)染方式可降低對(duì)種子細(xì)胞的毒性，以及如何提高干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率等。

2.3 ADSCs復(fù)合骨組織工程支架的局限性

目前對(duì)脂肪干細(xì)胞所構(gòu)建的組織工程骨支架的研究仍局限于細(xì)胞學(xué)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。體外及動(dòng)物和人體內(nèi)微環(huán)境的差異無法將研究結(jié)果推廣致臨床骨缺損的治療。由于各個(gè)研究中所用的脂肪獲取位置、提取、分離、培養(yǎng)方法及應(yīng)用劑量等無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且ADSCs表面不具有獨(dú)特細(xì)胞分子，因此提取出ADSCs純化度不高，導(dǎo)致ADSCs向骨細(xì)胞分化的效率低下。ADSCs仍處于試驗(yàn)階段，其用于臨床骨修復(fù)的報(bào)道相對(duì)較少。且臨床應(yīng)用多為修復(fù)頜面部骨缺損，而四肢骨缺損的治療尚未有明確報(bào)道。Castillo-cardiel等[18]報(bào)道其利用ADSCs治愈下頜骨缺損，Khojasteh等[19]也將ADSCs用于下頜牙槽嵴萎縮患者并取得良好的治療效果。雖然以上研究報(bào)道利用ADSCs治療骨缺損獲得良好效果，但其臨床安全性仍備受爭(zhēng)議。

3 總結(jié)與展望

查閱國內(nèi)外最新文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)近年來對(duì)ADSCs骨缺損修復(fù)材料的研究逐漸深入，但臨床應(yīng)用較少，因此，要加快實(shí)驗(yàn)成果轉(zhuǎn)化速度，盡早實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室研究成果應(yīng)用到臨床疾病的治療，減輕骨缺損患者的痛苦。但總體來說，ADSCs是一種理想的骨組織工程支架種子細(xì)胞。