宏基因組二代測序在非HIV重癥肺孢子菌肺炎患者中的應(yīng)用

梁艷 方婉娜 王天立 鄒葉強

耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii，PJ)是一種機會感染性病原體，可引起致命性的肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)。肺孢子菌感染多見于HIV感染、器官移植術(shù)后及長期應(yīng)用激素治療等免疫低下患者，也可在免疫力正常的機體內(nèi)定植[1]。隨著化療藥物、免疫抑制劑的廣泛使用，非HIV患者肺孢子菌肺炎發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢。臨床多以發(fā)熱、干咳和進行性呼吸困難等為主要癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，臨床病死率高達30%～50%以上。所以及時診斷和啟動PCP特異性治療是降低病死率的關(guān)鍵。但PCP的早期病原學(xué)診斷存在困難，傳統(tǒng)方法是將肺泡灌洗液(BALF)行特殊染色以查找肺孢子蟲包囊或滋養(yǎng)體，其在檢測時間、陽性率方面存在局限性，容易延誤診治。

宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)可以直接從臨床標(biāo)本中提取全部微生物的DNA和/或RNA進行測序，包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲[2]。mNGS 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的研究，在血液、腦脊液、BALF中提示出良好的診斷性能[3]。多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)不易獲得的寡養(yǎng)細菌、真菌、病毒等病原體可以通過mNGS檢測從呼吸道標(biāo)本中檢出[4，5]?，F(xiàn)將我院2020年6～12月收治于呼吸重癥監(jiān)護病房的4例非HIV感染重癥PCP患者的臨床資料報道如下，以進一步評估m(xù)NGS在臨床工作中的應(yīng)用價值。

1 病例資料

1.1 病例1男，72歲，既往有間質(zhì)性肺炎、炎性肌病、2型糖尿病，潑尼松片口服2月余(30mg/d)、冠心病。因氣促、發(fā)熱3d入院。院外體溫最高38.0℃，咳白痰，伴氣促、乏力、心慌，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院肺部CT示雙肺炎癥，給予頭孢克肟0.1g tid 口服抗感染治療，患者癥狀加重遂入我科ICU。入科體格檢查：T：38.3℃，P：118次/min，R：28次/min(無創(chuàng)呼吸機、ST模式)，BP：117/73mmHg。嗜睡，雙肺呼吸音低，可聞及濕性啰音，血氣示I型呼吸衰竭。血常規(guī)：白細胞：9.42×109/L，中性粒細胞：90%，淋巴細胞：0.26×109/L，血小板：201×109/L，PCT：12.1ng/ml，呼吸道九聯(lián)檢(軍團菌、支原體、衣原體、立克次體、腺病毒;甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒IgM抗體)：陰性，人免疫缺陷病毒抗體測定(HIV抗體)：陰性，LDH：1603U/L，BNP：3207pg/ml，肌酐：84μmol/L，T細胞免疫：CD4：84個/μl。入院診斷：①重癥肺炎、I型呼吸衰竭；②膿毒癥；③間質(zhì)性肺炎；④炎性肌病；⑤2型糖尿病。給予美羅培南(1g q8h靜滴)聯(lián)合莫西沙星(0.4g qd 靜滴)廣譜抗感染治療。入院后第2天患者病情加重伴血壓下降，給予有創(chuàng)呼吸機輔助通氣。行床旁支氣管鏡并行右肺下葉支氣管分泌物送細菌+真菌培養(yǎng)、BALF送mNGS。下呼吸道分泌物涂片示革蘭氏陽性球菌(+)，3d后mNGS回報耶氏肺孢子菌感染，序列數(shù)為25613，支氣管分泌物培養(yǎng)提示金黃色葡萄球菌，血培養(yǎng)陰性。遂調(diào)整抗菌藥物為哌拉西林他唑巴坦(4.5g q8h靜滴)、復(fù)方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)、利奈唑胺(0.6g q12h靜滴)聯(lián)合抗感染。治療3d后患者突發(fā)心臟驟停，家屬放棄治療并出院。

1.2 病例2男，70歲，既往有腎病綜合征3個月，現(xiàn)口服潑尼松片50mg/d。因氣促半月，加重1周入院。院外以活動后氣促為主，偶有咳嗽、低熱，具體體溫不詳，夜間可平臥。院外抗感染治療后癥狀無緩解。近1周氣促癥狀加重收入我科ICU。入科體格檢查：T：37.8℃，P：107次/min，R：25次/min（無創(chuàng)呼吸機輔助，ST模式），BP：128/84mmHg。神清，雙肺呼吸音粗，可聞及濕性啰音。動脈血氣：PO2：44mmHg，PCO2：24.7mmHg。入院診斷：①重癥肺炎（細菌?肺孢子菌肺炎?）、I型呼吸衰竭；②腎病綜合征。給予莫西沙星（0.4g qd 靜滴）、復(fù)方磺胺甲噁唑片（3片q6h口服）抗感染治療。入院當(dāng)天給予支氣管鏡檢查，氣道分泌物送細菌檢查、BALF送mNGS。血常規(guī)：白細胞：13.25×109/L，中性粒細胞：92%，淋巴細胞：1.21×109/L，血小板：270×109/L，PCT：0.19ng/ml，IL-6：25.15pg/ml。呼吸道九聯(lián)檢：陰性，HIV抗體：陰性，LDH：586U/L，BNP：908pg/ml，肌酐：84μmol/L，T細胞免疫：CD4：56個/μl。G試驗：87.8pg/ml，GM試驗：陰性，2d后mNGS回報耶氏肺孢子菌感染，序列數(shù)為308。治療上同時給予營養(yǎng)支持，護胃、潑尼松40mg/d，5d后患者氣促癥狀緩解不明顯，遂加用卡泊芬凈（50mg qd 靜滴）聯(lián)合抗感染。治療10d后患者癥狀好轉(zhuǎn)出院，復(fù)查肺部CT病灶較前吸收。

1.3 病例3男，55歲，既往有腎病綜合征、Ⅱ期膜性腎病史。因咳嗽1個月，氣促、發(fā)熱20余天由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院轉(zhuǎn)入我科。體溫以低熱為主(＜38.5℃)，稍活動后氣促明顯，伴咳嗽，無胸痛。院前肺部CT示右下肺空洞性病變，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院考慮重癥肺炎、膿毒癥，先后給予莫西沙星、哌拉西林他唑巴坦、頭孢哌酮舒巴坦+替加環(huán)素抗感染。入科體格檢查:T:37.6℃，P:123次/min，R:22次/min(無創(chuàng)呼吸機輔助、ST模式)，BP:92/67mmHg。神清，雙肺可聞及濕性啰音。入院診斷:①重癥肺炎；②I型呼吸衰竭；③右下肺空洞性病變查因:曲霉?；④膿毒血癥；⑤腎病綜合征、Ⅱ期膜性腎病。入院后完善相關(guān)檢查: HIV抗體:陰性，T細胞免疫:CD4:108個/μl。同時行支氣管鏡檢查留取右下肺分泌物送細菌、真菌培養(yǎng)，留取BALF送檢mNGS。經(jīng)驗性給予頭孢哌酮舒巴坦(3g q8h 靜滴)聯(lián)合替加環(huán)素(50mg q12h 靜滴)。BALF送mNGS結(jié)果回報示耶氏肺孢子菌感染，序列數(shù)為1749，CMV病毒序列數(shù)為969。停用替加環(huán)素，給予復(fù)方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)、卡泊芬凈(50mg qd 靜滴)抗肺孢子菌治療。12d后，患者氣促、咳嗽較前好轉(zhuǎn)，出院后繼續(xù)口服復(fù)方磺胺甲噁唑片鞏固治療，復(fù)查肺部CT病灶吸收好轉(zhuǎn)。

1.4 病例4男，62歲，既往有慢性淋巴細胞白血病病史及R-FC化療史。因發(fā)熱6d并氣促轉(zhuǎn)入我科ICU。院外肺部CT示雙肺磨玻璃樣改變，體溫最高39.5℃。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院給予頭孢他啶、莫西沙星、氟康唑抗感染治療。入科體格檢查：T：38.3℃，P：115次/min，R：37次/min，BP：108/70mmHg。神清，雙肺可聞及濕性啰音。入院診斷：①發(fā)熱查因：重癥肺炎（細菌?肺孢子菌肺炎?病毒?）；②I型呼吸衰竭；③慢性淋巴細胞白血病化療后。入院后第2天行支氣管鏡檢查留取右下肺分泌物送細菌、真菌培養(yǎng)，留取BALF送檢mNGS。給予美羅培南(1g q8h 靜滴)聯(lián)合卡泊芬凈(50mg qd 靜滴)。檢查結(jié)果回報：血常規(guī)：白細胞：4.03×109/L，中性粒細胞：72.6%，淋巴細胞：0.79×109/L，血小板：59×109/L，PCT：0.3ng/ml，呼吸道九聯(lián)檢：陰性，HIV抗體：陰性，BNP：646pg/ml，肌酐：72μmol/L，T細胞免疫：CD4：112個/μl。mNGS回報耶氏肺孢子菌感染，序列數(shù)為80，故停用美羅培南，改哌拉西林他唑巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)聯(lián)合卡泊芬凈(50mg qd 靜滴)抗感染。9d后患者癥狀好轉(zhuǎn)，出院繼續(xù)鞏固治療。復(fù)查肺部CT病灶較前吸收。

2 討論

mNGS是對樣本中的總DNA或RNA進行測序后再通過生物信息分析軟件全面鑒定細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體[2]，它提供的是一種無偏的分析方法，理論上可識別所有已知序列的病原體，實現(xiàn)了從人體活檢樣本和體液(包括血液、尿液、腦脊液、胸腹水、局灶穿刺物、組織等)中檢出病原體的目標(biāo)。mNGS在死菌，使用抗生素的細菌，罕見、不典型及未知病原體，復(fù)雜混合感染的檢出中優(yōu)勢明顯。2014年Wilson等[6]報道了一名14歲男孩因不明原因腦積水、發(fā)熱入院，最終利用mNGS方法檢測出了腦脊液中存在鉤端螺旋體，從而挽救了患兒生命的病例。

非 HIV 型 PCP 不同于 HIV 型 PCP。前者急性起病且進展快、病情重，普通檢查常難以確診，這就給非HIV感染的重癥肺孢子菌肺炎患者帶來了診斷上的困難，從而導(dǎo)致治療延誤，預(yù)后極差，病死率高[7，8]。mNGS克服了核酸診斷方法的局限性，因為它不需要預(yù)先了解或假設(shè)引起感染的病原體類型，就能檢測新的和突發(fā)的病原體。本研究報道的4例患者均為非HIV患者，在常規(guī)經(jīng)驗抗感染效果欠佳的情況下，通過對患者BALF進行mNGS檢測均發(fā)現(xiàn)高序列肺孢子菌，確診為PCP。其中第1例患者在確診后積極給予抗PJ治療，但由于突發(fā)心臟驟停，家屬放棄治療并出院，其余3例患者在確診后及時精準(zhǔn)治療均病情好轉(zhuǎn)出院。研究顯示[9]，通過mNGS早期明確診斷后，臨床依據(jù)結(jié)果調(diào)整患者治療方案，患者28d、90d生存率均有所提高，90d生存率從57.7%提高至83.3%。由于我國醫(yī)療水平存在地區(qū)差異，抗生素使用情況不容樂觀，mNGS受抗生素影響小，在使用抗生素的前提下，mNGs的陽性率(91.3%)顯著高于傳統(tǒng)方法(43.5%)[3，10]，當(dāng)然mNGS也有局限性，mNGS檢測技術(shù)水平高，存在去人源化難度大、對RNA病毒檢出率低、真菌和結(jié)核菌提取DNA相對困難等問題，尚缺乏統(tǒng)一、完善的檢測流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[11]。所以臨床醫(yī)生需要密切結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)和檢查資料，避免非致病菌干擾并作出正確判讀[12]。

綜上，mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中發(fā)揮重要作用，其敏感性高，確診時間快，可及時發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法不易檢出的致病菌，達到縮短病程，減少不必要的抗生素的使用，降低醫(yī)療成本的目的。對于具有“疑難、危重、特殊”特點的感染患者可以早期實現(xiàn)從“精準(zhǔn)診斷”到“精準(zhǔn)治療”的過程，提高救治成功率。