小鼠心肌梗死模型的快速制作方法研究

張寧坤，高連如，趙 力，王麗華，朱 瑩，劉秋穎，劉 玲，苗 晨，郝 璐，陳 宇

心肌梗死是心血管疾病中最危急事件[1]。我國每年新發(fā)急性心肌梗死約100萬人，并有低齡化的趨勢，急性心肌梗死死亡率居高不下，研究心肌梗死病因、病理等發(fā)病機制，研發(fā)新的治療方法和藥物是心血管疾病領(lǐng)域的重要研究方向。在心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病基礎(chǔ)研究及干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究中，動物心肌梗死模型被廣泛應(yīng)用，在其模型制作中由于小鼠繁殖力強、易于飼養(yǎng)、價格低廉、占用空間少、操作簡便，小鼠染色體在進(jìn)化的過程中保留了人類同線性基因群，小鼠基因在一定程度與人類基因同源性強[2]，通過小鼠模型可從分子、細(xì)胞、形態(tài)學(xué)、發(fā)育、電生理和行為等多方面研究人類病因[3]，因此，在基礎(chǔ)研究中使用小鼠作為動物模型也更為廣泛[4-5]。小鼠心肌梗死模型的制作方法有藥物法、電刺激法、電凝燒灼法[6]、冷凍法及冠狀動脈結(jié)扎法，其中冠狀動脈前降支結(jié)扎法是目前實驗中最為常用的心肌梗死造模方法[7]，這種方法可直接造成冠狀動脈堵塞，實驗周期短，可以觀察梗死后對心肌的損害[6]。現(xiàn)有的操作方式是將小鼠麻醉后氣管插管，機械輔助通氣，開胸后進(jìn)行前降支結(jié)扎。此方法操作環(huán)節(jié)多，耗費時間長，小鼠胸腔開口視野小，心臟搏動快，在胸腔內(nèi)進(jìn)針結(jié)扎極易扎到心房，是引起小鼠死亡的最多因素。為解決這一問題，本研究對高效快速制作小鼠心肌梗死模型方法經(jīng)過深入研究[8]，強化操作技能訓(xùn)練，建立了一套獨特的快速制作小鼠心肌梗死模型的方法，減少操作環(huán)節(jié)，優(yōu)化流程，為快速大量制作小鼠心肌梗死模型提供了一個優(yōu)良的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性BALB/c小鼠100只，體質(zhì)量(20±2)g，購于北京科宇動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2018-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗。

1.1.2 試劑和儀器 異氟烷(江蘇恒豐強生物技術(shù)有限公司)，氧氣(北京東方醫(yī)用氣體有限公司)，HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，超聲(Vivid7，美國GE公司)，顯微鏡(CKX-41，日本奧林巴斯公司)，小動物心電圖機(ZS-2000，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物麻醉 用氣體流量管連接好氧氣、麻醉機、氣體分流器、麻醉誘導(dǎo)箱，調(diào)整異氟烷的濃度為3%誘導(dǎo)麻醉模式，打開分流器將異氟烷與氧氣的混合氣輸入至麻醉誘導(dǎo)箱。每次在麻醉誘導(dǎo)箱中放入5只小鼠，麻醉時間為1 min，小鼠麻醉后，調(diào)整麻醉機參數(shù)使異氟烷的濃度為1.5%持續(xù)麻醉模式，再調(diào)整氣體分流器將異氟烷與氧氣的混合氣持續(xù)輸入至麻醉誘導(dǎo)箱和小鼠手術(shù)臺呼吸面罩，將已經(jīng)麻醉的小鼠從麻醉誘導(dǎo)箱中取出，口鼻放入小鼠手術(shù)臺上呼吸面罩內(nèi)，小鼠仰臥在手術(shù)臺，四肢用膠帶固定。

1.2.2 模型制作 小鼠左前胸備皮后碘伏消毒，用10 cm手術(shù)剪在胸骨左緣第3～4肋間胸大肌前沿剪開皮膚，開口尺寸為0.5～1.0 cm用鑷子夾住皮膚，止血鉗在皮膚下分離胸大肌與皮膚，再用鑷子夾住胸大肌，止血彎鉗探入胸大肌下夾住胸小肌進(jìn)行兩者分離，此時明顯可見第3～4肋骨，止血彎鉗通過3～4肋間探入胸腔左右輕輕分開肋骨，左手在小鼠體外用拇指抵住小鼠腹腔左上部，中指彎曲抵住小鼠腹腔右側(cè)，食指抵住小鼠胸腔右側(cè)。先輕輕用力反復(fù)擠壓胸腔，待見到心尖部位于胸腔開口處時再同時擠壓胸腔，配合調(diào)整止血鉗撐開肋骨開口大小。隨著心臟自主收縮搏動，小鼠心臟游離端即可通過3～4肋間開口跳出胸腔。迅速用7-0縫合線平左心耳下緣進(jìn)針，向心臟右側(cè)至肺動脈圓錐與心尖部連線處出針，在目視下結(jié)扎前降支，左心室前壁(left ventricular anterior wall，LVAW)心肌顏色變淡，止血鉗再從心臟下面探入3～4肋間胸腔開口處輕輕撐開肋骨。隨著心臟自主收縮，心臟迅速收回到胸腔，左手拇指、食指和中指配合輕輕擠壓胸腔，擠出胸腔內(nèi)空氣，用止血鉗鉗合肋骨，迅速將胸小肌復(fù)位于3～4肋間上，胸大肌覆蓋于胸小肌之上，胸部皮膚切口兩側(cè)鉗夾合攏，用6-0號線縫合皮膚切口。術(shù)后切口碘伏消毒，脫呼吸面罩，將小鼠置于37 ℃動物復(fù)溫電熱毯上。

1.2.3 心電圖檢查 在術(shù)后進(jìn)行心電圖檢查，用針電極刺穿小鼠四肢，電極連接心電圖機檢測小鼠心電圖，觀察ST段抬高情況。

1.2.4 超聲檢查 在術(shù)前和術(shù)后2周進(jìn)行超聲檢查。小鼠胸骨左右兩側(cè)皮膚脫毛，使用14.0 MHz高頻超聲探頭檢查小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)及LVAW厚度。

1.2.5 小鼠心肌組織外觀和病理學(xué)檢查 小鼠心肌梗死模型制作2周后處死小鼠，取出心臟，與正常小鼠的心臟對比觀察心臟前壁外觀情況，經(jīng)冠狀面切開小鼠心臟，觀察LVAW厚度。石蠟包埋心臟進(jìn)行病理切片，厚度5 μm，進(jìn)行HE染色，觀察LVAW的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 模型制作成功率 100只小鼠前降支結(jié)扎制作心肌梗死模型后，誘導(dǎo)麻醉及持續(xù)麻醉期間小鼠心律、呼吸均正常，無死亡，術(shù)中無死亡，術(shù)后2周內(nèi)死亡4只，小鼠心肌梗死模型快速制作后存活率達(dá)96%。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠因心肌梗死面積過大，導(dǎo)致死亡。而存活小鼠中，2只小鼠超聲心功能檢查及病理檢查未符合心肌梗死表現(xiàn)，心肌梗死模型成功率94%。

2.2 模型制作時間 本方法開胸時皮膚是實際剪開，在分離胸大肌和胸小肌以及分離肋間時均是鈍性分離，不進(jìn)行任何剪切，肌肉沒有機械損傷，有利于傷口恢復(fù)。術(shù)者通過熟練的操作手法完成從開胸、擠出心臟、結(jié)扎前降支到關(guān)胸的步驟，在(40±10)s內(nèi)完成(圖1)。心臟整體目視下的冠脈前降支結(jié)扎可達(dá)到100%的結(jié)扎率，胸腔開放時間為15～30 s。在關(guān)胸同時，通過左手的熟練操作擠壓出胸腔空氣，覆蓋胸小肌、胸大肌及縫合時保證胸腔負(fù)壓，即刻能恢復(fù)自主呼吸，撤除呼吸面罩后，1 min后即可蘇醒。

圖1 制作小鼠心肌梗死模型操作方法

2.3 心電圖檢查結(jié)果 小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高，圖2。

圖2 小鼠心肌梗死模型制作后心電圖

2.4 超聲檢查結(jié)果 M型超聲可見，術(shù)前小鼠左室舒縮功能節(jié)律性強，左室壁正常(圖3)。術(shù)后較術(shù)前LVAW出現(xiàn)節(jié)段性運動減弱或消失，梗死區(qū)域有心肌強回聲，LVAW組織發(fā)生重構(gòu)，舒縮功能減低，左室室壁厚度明顯變薄(圖4)；檢查小鼠心功能LVEF較術(shù)前降低[(27.5±3.9)%，P<0.01]，LVESD較術(shù)前增加[(1.07±0.23)mm，P<0.01]，LVEDD較術(shù)前增加[(1.4±0.29)mm，P<0.01]，LVFS較術(shù)前降低[(8.1±3.1)%,P<0.05]，LVAW較術(shù)前降低[(0.44±0.06)mm，P<0.01(圖5)。

圖3 小鼠心肌梗死模型制作前M型超聲

圖4 小鼠心肌梗死模型制作后M型超聲

圖5 小鼠心肌梗死模型制作前后超聲心功能檢查

2.5 病理檢查結(jié)果 小鼠心肌梗死后心臟整體外觀，前降支結(jié)扎處，LVAW明顯凹陷(圖6A)，正常小鼠心臟整體外觀飽滿圓潤(圖7A)；心臟冠狀切面可見模型小鼠LVAW厚度減低，顏色較其他組織變淺(圖6B)，較正常小鼠顯著減低，正常小鼠LVAW組織飽滿(圖7B)。病理檢查HE染色，可見心肌梗死小鼠LVAW出現(xiàn)大量瘢痕組織，顯示心肌梗死后心肌的重構(gòu)(圖6C)，而正常小鼠未見異常(圖7C)。

圖6 模型小鼠心肌梗死組織

圖7 正常小鼠心肌組織

3 討論

制作小鼠心肌梗死模型直接有效的方法是制造冠狀動脈前降支狹窄或堵塞，這種方法研究周期短，可以制造一個比較穩(wěn)定的缺血病變區(qū)，模型制作方便，可重復(fù)性強，效果顯著，符合臨床冠狀動脈缺血造成心肌梗死的病理發(fā)生發(fā)展過程，對研究心肌梗死的病理機制和尋求可采取的治療方案實用性更強，也更貼近臨床[6]。有學(xué)者報道，如果未造成完全的冠脈堵塞或形成缺血適應(yīng)可影響心肌梗死的形成[9]。因此，冠狀動脈徹底結(jié)扎對制作心肌梗死模型的成功尤為重要。

冠狀動脈前降支結(jié)扎法是目前國內(nèi)外常用的建立心肌梗死動物模型的方法，既往的冠狀動脈結(jié)扎法是經(jīng)肌肉或腹腔注射麻醉藥物，使小鼠持續(xù)麻醉，經(jīng)口氣管插管，呼吸機輔助呼吸，開胸結(jié)扎前降支。這種方法的優(yōu)點是：小鼠經(jīng)麻醉后可保持持續(xù)麻醉1 h以上，有充足的時間進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備和冠狀動脈前降支結(jié)扎[6]。缺點是：①小鼠的氣管狹窄，在經(jīng)口氣管插管時對插管的選擇非常有限，小鼠的插管因為更細(xì)，研究者多用光滑的細(xì)軟管[10]。在呼吸機輔助呼吸時因為通氣壓力增高會導(dǎo)致插管的深部與小鼠氣管密合不嚴(yán)，從而使通氣效率減低，引起小鼠死亡。②開胸結(jié)扎的時候，為保證關(guān)胸后胸腔閉合好，開口較小，進(jìn)針易扎到心房或左心耳引起大出血導(dǎo)致小鼠死亡。③呼吸機輔助呼吸使兩側(cè)肺組織有規(guī)律的膨脹，左肺的膨脹會擴張到胸腔開口處，在開胸或進(jìn)針結(jié)扎前降支時極易損傷肺組織，在關(guān)胸后引起氣胸等嚴(yán)重并發(fā)癥，極易導(dǎo)致小鼠的死亡。④肌肉注射麻醉藥物，通常使用速眠新、氯氨酮、水合氯醛、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、丙泊酚及甲托咪定[11]等，在手術(shù)操作時間不穩(wěn)定及小鼠耐受不同的情況下，會導(dǎo)致麻醉藥物的麻醉效果降低；如果再追加麻醉藥物大多效果不佳。如果追加過量，手術(shù)后較長時間小鼠不易蘇醒，而且由于中樞神經(jīng)的抑制、體溫下降、無法自主呼吸最終死亡率增高。

本方法將小鼠的心臟擠出胸腔，目視下結(jié)扎冠狀動脈前降支，視野開闊目標(biāo)清晰。也有學(xué)者嘗試了這種方法，但操作難度太大，主要是開胸和擠出心臟時方法不正確，時間較長，死亡率高[12]。本研究團(tuán)隊進(jìn)行了大量的學(xué)習(xí)和強化訓(xùn)練后，優(yōu)化了操作環(huán)節(jié)，壓縮各步驟的操作時間來完成小鼠心肌梗死模型的制作，突出的優(yōu)點是：①在熟練的操作流程下，短時間內(nèi)完成手術(shù)，不需要氣管插管，麻醉使用異氟烷與氧氣混合氣體經(jīng)呼吸面罩輸送給小鼠進(jìn)行全身麻醉[13]，此麻醉方法與肌肉注射麻醉藥物的方法都是抑制小鼠中樞神經(jīng)達(dá)到麻醉效果，本方法麻醉效率高，給小鼠輸入麻醉混合氣體后，通常在1 min左右迅速達(dá)到麻醉效果，撤除麻醉混合氣體后，小鼠短時間內(nèi)即解除對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，很快蘇醒，有時蘇醒的時間不會超過1 min，避免了小鼠術(shù)后持續(xù)抑制中樞神經(jīng)而引起的一系列后果。②在開胸結(jié)扎前降支時只有皮膚是剪開的，其余的肌肉組織分離都是鈍性分離，肋間開口能使心臟移出胸腔即可，開口不宜過大，避免了不必要的失血和后續(xù)關(guān)胸不嚴(yán)造成氣胸的嚴(yán)重問題，利于傷口愈合和呼吸功能在術(shù)后的迅速恢復(fù)。通過術(shù)者的熟練操作手法，可迅速將心臟擠壓出胸腔，心臟在胸腔外，肉眼直視可以清晰看到冠狀動脈前降支，心臟嵌在胸腔開口處更容易被固定，減少快速心律對心臟位置固定的影響，對進(jìn)針結(jié)扎前降支及出針位置會掌握的非常準(zhǔn)確，不會引起誤扎心房和左心耳導(dǎo)致出血和心律失常等并發(fā)癥的發(fā)生。關(guān)胸時術(shù)者順勢擠壓出胸腔氣體，止血鉗閉合兩肋骨迅速覆蓋胸大肌和胸小肌，建立胸腔負(fù)壓，保持小鼠正常呼吸。從止血鉗進(jìn)入胸腔到擠出心臟、結(jié)扎前降支、關(guān)閉胸腔這段操作過程的時間只有15～30 s，在胸腔開放的過程中，可以造成小鼠肺不張的情況，因為胸腔開放的時間非常短，不需做其他處理，心臟回復(fù)到胸腔后迅速關(guān)胸腔，關(guān)胸的過程同時制造了胸腔的負(fù)壓狀態(tài)，肺不張的情況立即緩解，恢復(fù)正常呼吸。操作過程中無因肺不張而導(dǎo)致小鼠呼吸困難和死亡的情況，這是本研究的重點核心步驟，操作過程幾乎沒有影響到小鼠的自主呼吸，撤除麻醉后即可蘇醒。

判定小鼠心肌梗死模型是否成功，通常使用超聲或心電圖檢查，為實現(xiàn)交叉印證心肌梗死情況，可以使用多因素共同判斷，①心電圖判斷，小鼠的心肌梗死心電圖與大鼠類似，在心肌梗死模型制作完成后，連接肢體導(dǎo)聯(lián)，2個或2個以上相鄰導(dǎo)聯(lián)Q波形成且>1/4R波，寬度>0.04 s，ST段抬高0.2 mV可判定為心肌梗死[14]。②超聲檢查心功能，小鼠體積小，胸壁薄距心臟距離短，要使用高頻探頭進(jìn)行檢查[15]，通常用12～14 MHz超聲探頭，小鼠心肌梗死2周后，梗死部位即發(fā)生心肌組織重構(gòu)，與術(shù)前相比LVEF和LVFS會明顯減低，LVESD和LVEDD會明顯增加，LVAW厚度明顯減低、運動功能明顯減弱。③直觀心肌前壁組織變化，處死小鼠取心臟后，觀察LVAW與正常小鼠的不同，心肌梗死小鼠LVAW凹陷，顏色變白，厚度明顯低于正常組小鼠LVAW認(rèn)為心肌組織已經(jīng)因為心肌梗死發(fā)生嚴(yán)重的心肌重構(gòu)。④病理學(xué)檢查，心肌重構(gòu)的部位心肌細(xì)胞丟失嚴(yán)重，瘢痕組織會代替丟失的心肌細(xì)胞，失去活力，HE染色可見明顯的瘢痕組織形成，為心肌梗死后心肌重構(gòu)的重要表現(xiàn)。

以本研究方法制作的心肌梗死模型，小鼠死亡率低，成模率高，減少了手術(shù)操作的時間，可以在短時間內(nèi)大量迅速制作小鼠心肌梗死模型，提高了大規(guī)模制作小鼠心肌梗死模型進(jìn)行相關(guān)實驗研究的效率。