Nrf2調(diào)控自噬對于宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用及機制研究

李曉蘭，趙駿達，馬俊旗

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居高不下，各病理類型以宮頸鱗狀細胞癌最多見。其發(fā)病機制尚不明確，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，早期識別、干預(yù)宮頸癌對于其預(yù)后及治愈均有重要的臨床意義[1]。而核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)蛋白的異常表達與自噬的相互作用可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。

1 材料與方法

1.1 研究對象 宮頸癌標本及其癌旁組織各50例均來自于2018年1月-12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的宮頸癌患者，所有的標本經(jīng)兩位病理醫(yī)師證實，均為宮頸鱗狀細胞癌，患者術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療。Beclin-1、LC3、p62、Nrf2均為兔抗人多克隆抗體，購自美國ABGENT公司；DAB顯色試劑盒、SP免疫組織化學(xué)試劑盒(PV-9000)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。人宮頸癌SiHa細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司，根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范，使用慢性宮頸炎患者切除的新鮮宮頸組織作為正常對照。所有患者知情同意，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌SiHa細胞細胞培養(yǎng) 宮頸癌SiHa細胞按常規(guī)細胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。消化傳代使用含有EDTA的0.25%胰酶，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的宮頸癌SiHa細胞經(jīng)胰酶消化后，以1×105/mL密度接種于6孔板中，待細胞生長至80%融合時，取2 μg質(zhì)粒加入到200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中輕輕搖勻后在室溫下放置5 min；取10 μL脂質(zhì)體加入到200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中輕輕搖勻后再在室溫下放置5 min；然后混合稀釋的脂質(zhì)體和質(zhì)粒輕輕搖勻，室溫孵育30 min，最后將混合液輕輕加入到待轉(zhuǎn)染的細胞中，4～6 h后換液。

1.2.3 免疫組化 采用免疫組織化學(xué)超敏兩步法(SP法)染色，一抗均采用工作液(Beclin1、p62為1∶100稀釋；LC3為1∶50稀釋)，PBS為對照，操作步驟嚴格按照說明書進行，經(jīng)SP法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.2.4 Western Blot檢測蛋白表達量 在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA 48 h后處理細胞，提取總蛋白，4 ℃離心25 min后，用BCA測定蛋白含量，SDS-PAGE分離樣品并轉(zhuǎn)膜，4%BSA封閉1 h后分別加入Nrf2、p62、Bcl2、Bax抗體，抗體濃度均為(1∶1 000)，4 ℃過夜后，二抗(1∶2 000)4 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖 在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA處理細胞48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)，MTT法檢測細胞增殖改變情況。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁組織中Beclin1、LC3、p62和Nrf2的表達 免疫組化結(jié)果顯示，Beclin1、LC3、p62和Nrf2的陽性染色呈棕黑色顆粒，Beclin1陽性定位于細胞膜及細胞漿，LC3陽性定位于細胞漿及部分細胞核，p62陽性定位于細胞漿，Nrf2陽性定位于細胞核。Beclin1在宮頸癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為18.0%(9/50)、94.0%(47/50)；LC3在宮頸癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為20.0%(10/50)、92.0%(46/50)；p62在宮頸癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為78.0%(39/50)、14.0%(7/50)；Nrf2在宮頸癌組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為86.0%(43/50)、22.0%(11/50)。4種蛋白在宮頸癌組織及癌旁組織中表達水平均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)，提示在宮頸癌細胞內(nèi)Nrf2和p62蛋白顯著高表達，自噬表達水平較低。

表1 宮頸癌組織及癌旁組織中Beclin1、LC3、p62和Nrf2的表達組織

2.2 在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA后細胞凋亡改變情況 在宮頸癌細胞內(nèi)，Nrf2與p62均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)(P<0.05，圖1)；在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA及其陰性對照物后，細胞內(nèi)p62表達顯著下降，且抗凋亡蛋白Bcl2顯著下降，凋亡蛋白Bax表達上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)轉(zhuǎn)染p62 siRNA及其陰性對照物后，細胞內(nèi)Nrf2表達顯著下降，且抗凋亡蛋白Bcl2表達顯著下降，凋亡蛋白Bax表達上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)；提示在宮頸癌SiHa細胞內(nèi)，p62與Nrf2可成環(huán)調(diào)控，且兩者相互作用可顯著促進細胞凋亡。

圖1 宮頸癌組織及癌旁組織中Beclin1、LC3、p62和Nrf2的免疫組化Beclin1蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(×400)A:癌組織；B:癌旁組織；LC3蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(×400)C:癌組織；D:癌旁組織；p62蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(×400)E:癌組織；F:癌旁組織；Nrf2蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(×400)G:癌組織；H:癌旁組織

表2 轉(zhuǎn)染后宮頸癌SiHa細胞株Nrf2、p62基因表達

圖2 宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)Nrf2和p62表達情況與陰性對照組比較，*P<0.05

2.3 在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA后細胞增殖改變情況 分別在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA及其陰性對照物、p62 siRNA及其陰性對照物后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h和72 h，結(jié)果顯示，細胞增殖在Nrf2 siRNA和p62 siRNA組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)，提示在宮頸癌SiHa細胞內(nèi)，抑制Nrf2和p62的表達可以顯著抑制細胞增殖，具有時間依賴效應(yīng)，圖4。

圖3 在宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA后細胞凋亡改變情況

圖4 宮頸癌SiHa細胞株內(nèi)分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和p62 siRNA后細胞增殖改變情況

3 討論

宮頸癌在全球各地均有發(fā)生，是人體最常見的惡性腫瘤之一，居于女性惡性腫瘤的首位。臨床流行病學(xué)結(jié)果顯示，從一般的宮頸癌首病變誘發(fā)為宮頸癌約10年時間，提示宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)可能使其成為一種可以預(yù)防和治愈的疾病[2-4]。因此，研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制對于宮頸癌的治療具有重要的意義。

自噬是一種高度保守的真核細胞內(nèi)分解代謝過程，其特點是在細胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體吞噬細胞內(nèi)受損的細胞器[5]。自噬由壓力信號-哺乳動物雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)始動，mTORC1 激活激酶ULK1(ATG1)，繼而形成ATG13和ATG17復(fù)合物[7]。mTORC1活性受到抑制后，自噬小體開始形成，其形成還需要激活由Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶與Beclin1所形成的復(fù)合物。LC3II通過ATG7和ATG3進入自噬小體膜內(nèi)。LC3II蛋白還需要一些支架蛋白的協(xié)助，如p62和NIX，通過它們可以識別并結(jié)合聚集的蛋白和受損的細胞器，將其帶入自噬小體內(nèi)部進行降解[6-9]。自噬小體隨后與溶酶體形成自噬溶酶體，自噬小體內(nèi)的物質(zhì)受到許多不同的溶酶體蛋白的降解，為細胞代謝和細胞器的更新提供能量和原料[10-12]。大多數(shù)的相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn)，自噬在健康細胞內(nèi)可以起到抑制腫瘤的作用，而在多種腫瘤中均異常存在[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織內(nèi)，自噬蛋白呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，自噬行程標志性蛋白Beclin1、LC3表達顯著低于癌旁對照組組織，同時自噬降解關(guān)鍵蛋白p62表達異常升高，本研究結(jié)果印證了前期研究結(jié)論，進一步證實在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬確實發(fā)揮著重要作用。

氧化應(yīng)激是指由于氧自由基過量生成和/或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，對細胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。Nrf2是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在參與細胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機制中發(fā)揮重要作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中，Nrf2異常高表達，自噬表達水平較低，提示在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Nrf2與自噬的共同作用可能影響細胞的增殖與凋亡。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌細胞SiHa轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA及p62 siRNA后，Nrf2與p62的表達呈正相關(guān)，均顯著下調(diào)細胞增殖，促進細胞凋亡。表明在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，Nrf2、p62反饋環(huán)的存在是自噬與氧化應(yīng)激聯(lián)系的關(guān)鍵，可以進一步調(diào)控宮頸癌細胞的增殖與凋亡，該研究結(jié)果與有關(guān)報道相一致。據(jù)報道p62可以通過Keap1降解而激活Nrf2信號通路發(fā)揮細胞保護作用，預(yù)防軟脂酸誘導(dǎo)的脂中毒及防止羰基氰化物氯苯腙誘導(dǎo)的細胞凋亡。有研究表明，氧化應(yīng)激發(fā)生時，Nrf2的過度表達可以增加p62的mRNA水平，Nrf2結(jié)合到下游抗氧化元件p62啟動子區(qū)可以促進p62的生成[18-20]。提示p62與Nrf2之間可能存在正性反饋環(huán)。與本文的研究結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)在宮頸癌SiHa細胞內(nèi)，抑制Nrf2和p62的表達可以顯著抑制細胞增殖，重要的是具有時間依賴效應(yīng)。

本研究證實在宮頸癌細胞內(nèi)，Nrf2與p62的負向相互作用可以顯著促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。下一步將對兩分子的具體作用機制展開研究。