早期不同壓力高壓氧對中重型顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經功能及IL-1β、IL-10和SOD表達的影響

齊亞南，潘樹義，郭大志

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是外科急癥之一，特別是中重型TBI，病死率高，預后差。TBI的病理生理過程包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，其中繼發(fā)性腦損傷是影響預后的最重要因素，神經炎癥和氧化損傷是繼發(fā)性腦損傷致病的最主要因素。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)能迅速有效的改善腦組織的缺氧狀態(tài)，具有減輕腦水腫、減輕炎癥、促進神經再生等作用，在TBI的治療中有廣泛應用。因此本實驗擬使用PCI3000精確顱腦撞擊儀(深圳瑞沃德科技公司)，采用控制性皮質撞擊(cortical impact injury,CCI)方法建立中重型TBI大鼠模型，分別給予1.5絕對大氣壓(atmosphere absolute,ATA)和2.5 ATA高壓氧處理，比較兩種不同壓力高壓氧對中重型顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經功能及白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-10和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級成年雄性SD大鼠[北京科宇動物養(yǎng)殖中心，SCXK(京)2006-008]，體質量250～300 g，共計75只分為5組。①TBI組(n=15)：建立TBI模型成功且術后第1天(D1)改良神經功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)7～18分；②假手術組(sham組，n=15)：僅將顱骨開窗，不予頭部打擊；③1.5 ATA組(n=15)：在TBI組的基礎上給予1.5 ATA治療；④2.5 ATA組(n=15)：在TBI組的基礎上給予2.5 ATA治療；(5)空白對照組(n=15)：不給予處理，正常飼養(yǎng)。預實驗結果表明sham組與空白對照組各觀察指標無顯著性差異。

1.2 TBI模型建立 利用PCI3000精確顱腦撞擊儀參照CCI方法建立模型[1]。術前大鼠均禁食禁水6～8 h。大鼠用小動物麻醉機(異氟烷)麻醉后，俯臥位將大鼠頭顱固定于腦立體定向儀上，調節(jié)儀器確保頭顱保持水平。備皮消毒后,沿顱頂正中剪開頭皮，分離骨膜，暴露顱骨，用腦立體定位儀確定打擊位置(前鹵后3.5 mm，中線偏左3 mm)，鉆約5 mm的骨窗，保持硬腦膜完整。打擊深度6 mm，打擊速度4 m/s，停留時間500 ms，撞擊桿撞擊大鼠硬腦膜。完成打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，碘伏消毒傷口。

1.3 高壓氧治療方案 大鼠顱腦創(chuàng)傷模型成功后，高壓氧組大鼠分別在術后D1進行1.5 ATA和2.5 ATA高壓氧治療，1/d(每次加壓5 min，穩(wěn)壓吸氧60 min，減壓5 min)，連續(xù)7 d。

1.4 模型評價方法 在術后D1、第3天(D3)、第7天(D7)進行mNSS評分[2]。評判標準：1～6分為輕型顱腦損傷；7～12分為中型顱腦損傷；13～18分為重型顱腦損傷。術后D1選擇mNSS評分為7～18分大鼠為中重型TBI模型。

1.5 血清 IL-1β、IL-10、SOD的含量測定 分別在術后D1、D3、D7采集各組大鼠的尾靜脈血，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清IL-1β、IL-10、SOD的含量。

1.6 腦組織 IL-1β、IL-10、SOD的含量測定 分別在術后D1、D3、D7處死各組大鼠，提取損傷側海馬處的腦組織，采用酶聯免疫吸附法檢測IL-1β、IL-10和SOD。

2 結果

2.1 不同壓力高壓氧對大鼠mNSS評分的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評分均高于sham組(P<0.05)，但3組間差異無統計學意義(P>0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評分均低于TBI組，差異有統計學意義(P<0.05)，1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，圖1。

圖1 各組大鼠不同時間神經功能缺損評分統計(aP<0.05)

2.2 不同壓力高壓氧對血清IL-1β、IL-10和SOD含量的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清IL-1β含量較sham組均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-1β含量較TBI組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但1.5 ATA與2.5 ATA組比較差異無統計學意義(P>0.05)，圖2A。在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清IL-10含量較sham組均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較TBI組明顯升高(P<0.05)，1.5 ATA組IL-10含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，圖2B。在D1和D3，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清SOD含量與sham組比較差異無統計學意義(P>0.05)；在D7，1.5 ATA組血清SOD含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，圖2C。

圖2 血清IL-1β、IL-10和SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

2.3 不同壓力高壓氧對腦組織內IL-1β、IL-10和SOD含量的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組腦組織IL-1β含量較sham組均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-1β含量較TBI組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但1.5 ATA與2.5 ATA組比較無統計學意義(P>0.05)，圖3A。在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較sham組均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組IL-10含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，圖3B。在D1和D3，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組SOD含量較sham組無明顯區(qū)別(P>0.05)；在D7，1.5 ATA組腦組織SOD含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，圖3C。

圖3 腦組織內IL-1β、IL-10、SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

3 討論

3.1 炎癥反應在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用和變化規(guī)律 大量臨床和基礎研究表明，炎癥反應和氧化損傷在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展和預后中起到關鍵作用[3-4]。IL-1β是一種促炎因子，能夠刺激粘附分子的表達，增加白細胞在內皮細胞的粘附，使白細胞聚集在缺血灶周圍，從而加重繼發(fā)性腦損傷及神經細胞凋亡，此外，IL-1β又能激活巨噬細胞和星形細胞，誘導神經細胞凋亡[5]。Ni等[6]證實，TBI大鼠與sham組、假手術組相比較，數小時內腦內IL-1β的含量明顯升高。給予骨髓間充質干細胞治療后，TBI組大鼠的IL-1β含量及mNSS評分均降低。本研究發(fā)現，中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織IL-1β的含量顯著升高，早期高壓氧治療可顯著降低IL-1β的含量，提示高壓氧可降低促炎因子水平，減輕神經炎癥損傷，但高壓力與低壓力高壓氧治療效果并無顯著性差異。

生物體內往往存在“自我平衡”機制，有促炎因子必有抗炎因子。IL-10便是體內抗炎因子的代表，主要來源于單核巨噬細胞和T輔助細胞，通過抑制多種炎癥因子的活化和炎癥因子的產生而降低炎癥反應[7]。Yuan等[8]研究發(fā)現，既往收治的顱腦創(chuàng)傷患者在入院48 h內IL-1β、IL-10的含量均明顯升高，且有研究發(fā)現在大鼠實驗中驗證得出，顱腦創(chuàng)傷組大鼠IL-1β、IL-10含量均高于sham組。這提示炎癥反應和抗炎過程是一對“雙生子”，始終貫穿于TBI的發(fā)生發(fā)展過程中。本研究發(fā)現，中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織IL-10的含量顯著升高，早期高壓氧治療可進一步促進IL-10含量升高，提示高壓氧不但具有抗炎作用，還可以增加機體自身抵抗炎癥損傷能力。此外，本研究發(fā)現低壓力高壓氧的“抗炎”效果更好。

血清SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質，能夠催化超氧陰離子等自由基發(fā)生歧化反應，維持機體內氧自由基的動態(tài)平衡[9]。SOD可提高機體抗氧化水平，降低氧化物的含量,減輕腦損傷周圍腦組織的氧化應激反應,促進腦損傷的恢復。Chen等[10]研究顯示，TBI后6 h氧化應激即可顯著增加，大鼠血清中SOD含量先下降、后升高，表明氧化應激反應是TBI腦損傷的重要機制之一。本研究進一步探討高低兩種壓力高壓氧治療對氧化損傷的作用效果發(fā)現，早期高壓氧治療可顯著增加中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織中SOD含量升高，且1.5 ATA組大鼠SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，提示早期高壓氧治療不僅不會增加氧化損傷，反而具有增加機體抗氧化應激能力，且低壓力高壓氧效果更優(yōu)。

3.2 高壓氧壓力在神經損傷中的作用 大量研究表明高壓氧對腦損傷具有積極的治療作用及效果[11]。但是，尚不清楚哪種高壓氧治療壓力更有利于降低神經細胞的炎性反應，更有利于促進腦損傷的恢復。Cui等[12]對現有的動物實驗進行Meta分析發(fā)現，給予腦損傷大鼠3.0 ATA高壓氧治療與2.0 ATA高壓氧治療，均可減輕腦水腫情況，但并無明顯差別。研究發(fā)現，給予腦損傷大鼠2.5 ATA、3.0 ATA高壓氧治療后，梗塞面積及血流均明顯改善[13-14]。上述研究提示，高壓力的高壓氧對減輕腦水腫、改善損傷區(qū)域血供和氧供效果更好。此外，Harch等[15]發(fā)現給予腦損傷大鼠1.5 ATA高壓氧治療后，大鼠在水迷宮實驗中學習成績顯著提高。Kusuda等[16]研究發(fā)現，給予帕金森病模型大鼠1.3 ATA高壓氧治療后，高壓氧組大鼠在旋轉木馬和平衡木試驗中評分均優(yōu)于對照組。以上文獻報道說明，低壓力的高壓氧治療在促進神經損傷方面也有著一定的療效。因此，未來有必要進一步研究高壓氧壓力在治療不同類型神經損傷中的作用和機制。

本研究結果發(fā)現，早期高低不同壓力高壓氧治療均可促進中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經損傷恢復，減輕神經炎癥和氧化損傷，“低壓力”高壓氧的抗炎和抗氧化的能力優(yōu)于“高壓力”高壓氧，從經濟性和安全性角度考慮，低壓力高壓氧在中重型創(chuàng)傷性腦損傷的治療中更值得臨床推廣。但是，本研究尚存在以下不足：(1)本實驗采用嚙齒類動物大鼠作為研究對象，其自身神經損傷修復能力比靈長類(人)強，減少了不同處理組效果的差異性；(2)炎癥反應往往發(fā)生于創(chuàng)傷性腦損傷的數分鐘到數小時內，本研究是比較不同壓力高壓氧治療后1 d、3 d和7 d的IL-1β、IL-10、SOD表達情況，其可能不是炎癥反應的關鍵作用時間。將來需要更進一步的動物和臨床研究。