外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中的作用及應(yīng)用研究進展

趙炳佳，梁曉春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730

國際糖尿病聯(lián)盟最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，2019年全球糖尿病患者達4.63億，我國患者最多，高達1.164億[1]。糖尿病一系列并發(fā)癥中以神經(jīng)病變最為常見，至少50%的患者最終會罹患糖尿病神經(jīng)病變，其致殘率和病死率均較高[2]。目前，研究人員從晚期糖基化終產(chǎn)物、多元醇通路、蛋白激酶C通路、氧化應(yīng)激、自噬等方面對糖尿病神經(jīng)病變的病理機制進行了大量研究，但臨床治療效果并不理想[3]。近年來，越來越多的研究表明，外泌體有望成為糖尿病神經(jīng)病變診治研究的新方向。外泌體是一種納米級細胞外囊泡，直徑30～150 nm，具有脂質(zhì)雙分子層外膜結(jié)構(gòu)，攜帶著豐富的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，廣泛存在于各種組織、血清、尿液中[4～6]。外泌體信號傳遞不同于其他經(jīng)典的細胞間信號通訊方式。在高糖病理狀態(tài)下，神經(jīng)元及其膠質(zhì)細胞外泌體的合成、釋放和轉(zhuǎn)運會發(fā)生質(zhì)和量的變化，從而影響靶細胞的生長和發(fā)育[7]?，F(xiàn)就外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中的作用及應(yīng)用研究進展綜述如下。

1 外泌體參與糖尿病神經(jīng)病變進程的分子基礎(chǔ)

外泌體是由胞膜內(nèi)吞形成管腔囊泡，經(jīng)過內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體和神經(jīng)酰胺相互作用后包裹脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等“貨物”形成多囊泡體，最后與胞膜融合并向外釋放的囊泡小體[5,8]。合成的外泌體能夠通過血液、組織液等方式進入到全身各個組織細胞中，釋放出內(nèi)容物，傳遞來源細胞的信號，調(diào)節(jié)靶細胞相應(yīng)的生理活動。糖尿病來源的外泌體本身攜帶致病信息，游走在心肌、內(nèi)皮等組織中則會造成不同程度的病變[9]。有研究證實，外泌體能夠透過血腦屏障進到腦組織中[10]。這表明糖尿病來源的外泌體也很有可能由此進入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，造成進一步代謝損傷。

多項研究顯示，外泌體中的脂質(zhì)分子數(shù)量和種類豐富，含有鞘磷脂、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂等，并有著豐富的生理功能[11]。如神經(jīng)節(jié)苷脂能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)的生長發(fā)育，研究證實其能改善糖尿病周圍神經(jīng)病患者的癥狀[12]。同時，外泌體為雙層膜結(jié)構(gòu)，對其在血液和神經(jīng)組織中的流動和轉(zhuǎn)運具有重要意義。研究表明，外泌體膜外的鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂含量比值對外泌體的流動性有顯著影響[13]。這對進一步研究外泌體在全身各組織的轉(zhuǎn)移能力和流動性非常有意義。

外泌體普遍含有跨膜蛋白、GPI錨蛋白、熱休克蛋白等。不同組織細胞來源的外泌體有著特異性的膜蛋白，如神經(jīng)元外泌體中含有乙酰膽堿酯酶或β淀粉樣蛋白等。這種特異性膜蛋白可作為鑒別和純化神經(jīng)元來源外泌體的陽性標(biāo)志物，而且，外泌體攜帶的功能性蛋白質(zhì)能夠進入不同組織中發(fā)揮作用。如有些外泌體中攜帶細胞因子、生長因子、纖維連接蛋白、膠原等，而這些蛋白與糖尿病狀態(tài)下神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)、修復(fù)、再生以及微環(huán)境的形成密切相關(guān)[5]。

除了豐富的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子，外泌體中還存在著數(shù)量可觀又復(fù)雜的核酸分子，在細胞間信息傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要功能[14]。Krishnan等[15]通過對糖尿病患者胰島組織來源的外泌體中所有RNA進行高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)一共有72條RNA(包括mRNA、miRNA、piRNA、IncRNA、snoRNA、tRNA)表達水平具有統(tǒng)計學(xué)差異，并且通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些RNA與胰島素分泌、鈣離子信號通路及細胞凋亡等密切關(guān)聯(lián)，但具體分子機制有待進一步闡明。還有研究表明，病理狀態(tài)下的RNAs亦能夠通過外泌體轉(zhuǎn)運到神經(jīng)組織細胞中，如神經(jīng)元、雪旺細胞等，在其中釋放后影響細胞中的基因表達和蛋白合成[4]。

2 外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中的調(diào)節(jié)作用

在神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體可來源于神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞以及雪旺細胞[16]。高糖狀態(tài)容易造成神經(jīng)軸突萎縮、神經(jīng)纖維功能喪失、髓鞘脫落、神經(jīng)元凋亡等，病理細胞來源的外泌體則會導(dǎo)致病變程度進一步惡化。這表明在糖尿病神經(jīng)病變中，外泌體可能參與了病理活動的進程。

2.1 外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用 研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)神經(jīng)元的外周細胞外泌體攜帶蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)進入神經(jīng)元后提高了神經(jīng)的再生能力、氧化應(yīng)激能力，起到修復(fù)高糖代謝損傷神經(jīng)元、促進神經(jīng)認知功能恢復(fù)的良性調(diào)節(jié)作用。如Venkat等[17]發(fā)現(xiàn)小鼠腦內(nèi)皮細胞來源的外泌體能夠在腦缺血區(qū)域通過增加神經(jīng)軸突、血管密度及上調(diào)miRNA-126誘導(dǎo)巨噬細胞聚集等發(fā)揮作用，促進2型糖尿病中風(fēng)小鼠神經(jīng)修復(fù)，顯著改善認知功能。而且，外泌體還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激的能力。Frohlich等[18]發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞外泌體能夠攜帶具有抗氧化應(yīng)激能力的超氧化物歧化酶和過氧化物歧化酶進入神經(jīng)元。隨著抗氧化應(yīng)激能力的增強，神經(jīng)元能夠維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，減少凋亡，發(fā)揮正常的神經(jīng)功能。

2.2 外泌體在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用 目前關(guān)于雪旺細胞外泌體與神經(jīng)元之間相互作用的眾多研究發(fā)現(xiàn)，健康細胞來源的外泌體能夠調(diào)節(jié)病理神經(jīng)細胞狀態(tài)，促進其恢復(fù)正常生理功能；相反，高糖病理狀態(tài)下的雪旺細胞來源外泌體則會對神經(jīng)元造成損傷，導(dǎo)致病情惡化。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)，來自RSC96雪旺細胞的外泌體對受到機械損傷的背根神經(jīng)元細胞具有促進增殖、延緩衰老、抑制凋亡的作用。Simeoli等[20]進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)背根神經(jīng)元受到損傷時，其miRNA表達失調(diào)，并且釋放出miR-21-5p表達上調(diào)的外泌體，該外泌體能夠募集巨噬細胞，進一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)，修復(fù)受損神經(jīng)元。但是，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，把高糖狀態(tài)下生長的雪旺細胞來源外泌體注射進小鼠坐骨神經(jīng)后，會加重糖尿病小鼠的周圍神經(jīng)病變程度。隨后，該研究發(fā)現(xiàn)，與正常雪旺細胞外泌體對比，高糖狀態(tài)下生長的雪旺細胞來源外泌體中miR-28、31a、130a高表達；在培養(yǎng)背根神經(jīng)元時加入該外泌體后發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)軸突生長受到抑制，并且軸突中相應(yīng)的靶蛋白如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a、內(nèi)吞銜接蛋白、突觸小體相關(guān)蛋白25、生長相關(guān)蛋白43表達均下降。后續(xù)實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-28、31a、130a的背根神經(jīng)元生長受到抑制，這進一步證實了高糖狀態(tài)下雪旺細胞外泌體及其表達的miRNA均加重了糖尿病周圍神經(jīng)病變過程[21]。

3 外泌體在糖尿病神經(jīng)病變治療中的應(yīng)用探索

多項研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病神經(jīng)病變與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脫髓鞘、突觸可塑性損傷、神經(jīng)萎縮等密切相關(guān)，而目前研究證實外泌體具有加強抗炎、抗氧化應(yīng)激、促進髓鞘再生、突觸重塑、神經(jīng)再生和修復(fù)等作用，這表明外泌體能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長與發(fā)育，對糖尿病神經(jīng)病變具有潛在的治療效果。

3.1 外泌體減輕炎癥反應(yīng) 在抗炎作用方面，有研究證實，來自骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可通過抑制促炎基因表達等治療糖尿病小鼠神經(jīng)病變，促進其神經(jīng)功能恢復(fù)。Kubota等[22]發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓間質(zhì)干細胞來源外泌體攜帶的miRNA-146a能夠預(yù)防糖尿病引起的海馬神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞損傷，最終促進神經(jīng)認知功能的恢復(fù)，而其具體機制則與抗炎作用有關(guān)。進一步地，F(xiàn)an等[23]將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體注射入糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠模型，結(jié)果顯示，小鼠熱痛閾值、感覺和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度等周圍神經(jīng)功能明顯改善；研究人員通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，該外泌體中高度表達Let-7a、miR-17、miR-23等，而這些miRNA與Toll樣受體(TLR)4/NF-κB信號通路密切相關(guān)，并且通過Western blotting實驗證實了注射該外泌體的糖尿病小鼠相比對照組，其坐骨神經(jīng)中TLR4、IRAK1、NF-κB p65的表達明顯降低。

3.2 外泌體抗氧化應(yīng)激 研究表明，干細胞外泌體增強了高糖下神經(jīng)元的抗氧化應(yīng)激能力，而且神經(jīng)元自身的外泌體能夠?qū)⒓毎麅?nèi)的過氧化物轉(zhuǎn)移出細胞，減輕了對神經(jīng)元的氧化損傷。Nakano等[24]發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓間質(zhì)干細胞來源外泌體具有抗氧化應(yīng)激能力，能夠增加神經(jīng)元突觸生長密度，改善糖尿病誘發(fā)的神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)異常，從而修復(fù)受損的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，減輕糖尿病大鼠的神經(jīng)認知功能障礙。另外，還有研究者證實，外泌體能夠?qū)碓醇毎麚p壞的染色體DNA片段運出細胞外，減輕細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[25]。這一點，對于減輕高糖狀態(tài)下的神經(jīng)元及其膠質(zhì)細胞的氧化應(yīng)激引起的DNA損傷尤其重要。

3.3 外泌體促進神經(jīng)修復(fù) 無論是神經(jīng)元還是干細胞來源的外泌體都攜帶著大量保護神經(jīng)和營養(yǎng)神經(jīng)的蛋白質(zhì)和核酸，可調(diào)節(jié)相關(guān)分子通路，起到保護髓鞘、重塑突觸、修復(fù)受損神經(jīng)元等作用，促進神經(jīng)元的生長與功能恢復(fù)，展示了潛在的治療前景。

在髓鞘保護方面，有研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞外泌體中攜帶大量的髓磷蛋白磷脂蛋白、2030-環(huán)核苷酸-磷酸二酯酶、髓鞘堿性蛋白等，而這些成分有利于形成神經(jīng)髓鞘，包裹神經(jīng)，形成保護作用和營養(yǎng)支持[26]。Pusic等[27]將提取自健康大鼠血清的外泌體加入大鼠海馬神經(jīng)組織中一起培養(yǎng)，結(jié)果顯示該外泌體能促進海馬中髓磷脂的表達、促進少突膠質(zhì)前體細胞和神經(jīng)干細胞的生長，且該外泌體富含miR-219。miR-219能夠明顯促進髓鞘再生，保護軸突，改善脫髓鞘病變，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[28]。

在突觸重塑方面，去極化神經(jīng)元釋放出的外泌體中富含突觸可塑性微管相關(guān)蛋白1B及其miRNA，而這對于神經(jīng)突觸重塑非常有意義[29,30]。同時，Xin等[31]發(fā)現(xiàn)，來自多功能性間充質(zhì)基質(zhì)細胞的外泌體能夠介導(dǎo)miR-133b轉(zhuǎn)移至星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，從而調(diào)節(jié)基因表達，有益于神經(jīng)突觸的重塑和功能恢復(fù)。另一方面，有學(xué)者證明，來自小鼠小膠質(zhì)細胞的外泌體能夠選擇性清除PC12神經(jīng)細胞的病理性突觸連接，保證正常的神經(jīng)突觸功能[32]。

在神經(jīng)生長方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在體外環(huán)境下間充質(zhì)基質(zhì)細胞來源外泌體能夠促進皮層神經(jīng)元軸突的生長和延長，而減少外泌體中RNA誘導(dǎo)沉默蛋白Ago2表達后，神經(jīng)軸突的生長則受到抑制；增加外泌體中miR-17-92表達后，其對神經(jīng)的促生長作用更強，該miRNA可能通過PTEN/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用[33]。另外，還有學(xué)者分別提取1型糖尿病大鼠骨髓基質(zhì)細胞和正常大鼠骨髓基質(zhì)細胞來源的外泌體，并分別注射進1型糖尿病腦卒中大鼠顱腦中，發(fā)現(xiàn)前者具有重塑腦血管和腦白質(zhì)的作用，檢測結(jié)果顯示前者血清miR-145表達下降，而miR-145靶基因腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白1和胰島素樣生長因子1受體的表達上升。研究進一步證實，轉(zhuǎn)染和敲除miR-145的外泌體影響了神經(jīng)的生長程度，表明miR-145在神經(jīng)保護中起到重要調(diào)節(jié)作用[34]。而在外周神經(jīng)系統(tǒng)方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雪旺細胞來源的外泌體能夠促進神經(jīng)軸突再生，修復(fù)坐骨神經(jīng)元損傷[35]。

綜上所述，外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中介導(dǎo)多種信號通路，在各個細胞間傳遞著不同訊息，調(diào)節(jié)著病理活動、生理功能。無論是髓鞘退化或形成，還是神經(jīng)細胞的凋亡和再生，外泌體均扮演著至關(guān)重要的作用。由于不同生理或病理狀態(tài)下，外泌體及其內(nèi)容物會發(fā)生相應(yīng)的差異性改變，若在其中尋找到生物標(biāo)志物，體液外泌體檢測或?qū)⒊蔀樘悄虿∩窠?jīng)病變早期有效的診療手段。而且，外泌體為自身分泌，能夠游走全身甚至透過血腦屏障，若將相應(yīng)藥物等包裹進外泌體，再被細胞靶向吸收，將會成為精準(zhǔn)治療的有效手段。然而，外泌體的具體調(diào)節(jié)機制如高糖狀態(tài)如何影響外泌體的形成與傳播等仍有待進一步研究探索。