糖尿病腎病中表達上調miRNA在腎臟內皮-間充質轉化中的調控機制研究進展

袁蕓，胡瓊英

1成都中醫(yī)藥大學，成都611137；2成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

糖尿病腎病(DKD)是常見的糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病微血管并發(fā)癥和終末期腎臟疾病的主要病因[1]。在多種致病因素單獨或協(xié)同作用下，DKD患者的腎組織將會發(fā)生一系列病理性改變，包括腎小球基底膜增厚、足突融合、足細胞丟失、系膜基質擴張及細胞外基質(ECM)沉積等，最終導致終末期腎臟疾病[2]。內皮-間充質轉化(EndMT)是內皮細胞在細胞因子刺激下，失去固有表型逐漸轉化為間充質樣細胞的過程，在各種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[3]。有學者在經典腎纖維化模型中研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞可由內皮細胞發(fā)生間充質轉化而來[4]。這一實驗結果反映出成纖維細胞的異質性，除了原本駐留的成纖維細胞外，內皮細胞也可成為其潛在前體，僅僅阻斷成纖維細胞活化不足以阻止腎纖維化的進展，如何控制內皮細胞的這種特殊轉化也至關重要。微小RNA(miRNA)是一種廣泛分布、長度約為22個核苷酸的內源性非編碼RNA，成熟的單鏈miRNA結合mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)介導靶基因轉錄后的基因沉默，從而誘導mRNA降解或抑制蛋白翻譯[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，體內差異性表達的miRNA參與心臟、腎、肝、肺等器官纖維化，通過抑制或促進各種基因和蛋白的活性，影響EndMT誘導的纖維化[6]。miRNA對DKD和腎纖維化的調控是多途徑的。本文現(xiàn)就糖尿病腎病中表達上調的miRNA在腎臟EndMT中的調控機制相關研究作一綜述，以期加深對DKD腎纖維化發(fā)病機制的了解，為其診斷和靶向治療提供新的生物標志物。

1 miR-21

在哺乳動物細胞中，miR-21是miRNA家族中表達最高的成員之一。Assmann等[7]對58例1型糖尿病患者(含23例對照組患者，18例中度DKD患者和17例重度DKD患者)的血漿進行miRNA表達分析，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在大量蛋白尿DKD患者血漿中表達明顯升高。

同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)是一種腫瘤抑制因子，可使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)去磷酸化，抑制蛋白激酶B(Akt)的磷酸化活性。Kumarswamy等[8]在轉化生長因子β(TGF-β)誘導的內皮細胞中觀察到miR-21高表達及Akt信號通路激活；過表達miR-21可模擬TGF-β的介導作用，降低內皮標志物血管內皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)的表達，增加間充質標志物成纖維細胞特殊蛋白的表達。該研究表明miR-21可通過沉默內皮細胞中的PTEN，以激活Akt介導的EndMT。另外，有報道指出TGF超家族骨成型蛋白7(BMP-7)通過下調miR-21發(fā)揮其對DKD纖維化的抑制作用[9]。因此，推測miR-21參與的TGF-β/BMP-7/miR-21/PTEN纖維化調控通路可能為控制DKD中EndMT的有效靶點。對于內皮細胞轉化為成纖維細胞后，miR-21是否及如何維持高水平表達，Sun等[10]對大鼠腎成纖維細胞進行了miR-21功能喪失/獲得實驗，發(fā)現(xiàn)下調miR-21可逆轉TGF-β介導的程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)下調，而過表達miR-21促進PDCD4降解；PDCD4通過抑制轉錄因子c-Jun磷酸化阻止活化蛋白1(AP-1)依賴性轉錄，使成纖維細胞標志物纖連蛋白(FN)和平滑肌肌動蛋白表達增加，促進miR-21維持高表達，形成miR-21/PDCD4/AP-1反饋調節(jié)；反饋環(huán)中產生的miR-21可以直接降解PTEN，將這種自我促進的反饋環(huán)與纖維化機制聯(lián)系起來，提示miR-21在腎纖維化持續(xù)惡化中的作用。然而，有學者認為miR-21在特殊情況下具有腎臟保護作用，整合在腎小管上皮細胞的miR-21可以直接靶向下游PDCD4/核因子-κB(NF-κB)和PTEN/Akt信號途徑，發(fā)揮抗炎癥和抗凋亡作用，減輕敗血癥引起的腎損傷[11]。

以上研究說明，miR-21具有雙重作用：一方面，通過TGF-β/BMP7-miR-21-PTEN、miR-21/PDCD4/AP-1等多途徑放大損傷反應并促進腎臟纖維化；另一方面，抑制細胞凋亡和炎癥反應使腎臟維持正常機能。miR-21在DKD中的作用機制還有待進一步研究證實。

2 miR-214

大多數(shù)情況下，miR-214被認為是骨代謝疾病的關鍵調控因子[12]。一項關于DKD中相關miRNA的生物信息學分析顯示，與正常對照組比較，DKD患者體內的miR-214-3p表達水平明顯增高[13]。

2014年，Denby等[14]實施單側輸尿管阻塞實驗(UUO)阻斷TGF-β/Smad信號通路，小鼠體內miR-214水平未受影響；miR-214抑制劑無法抑制Smad2/3的磷酸化，但能改善UUO引起的腎纖維化。以上結果表明miR-214的促纖維化作用獨立于TGF-β/Smad信號通路。隨后，Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214可靶向下調內皮細胞中PTEN表達，提示miR-214可能通過激活PTEN/Akt信號通路介導EndMT。另外，miR-214還參與調節(jié)內皮細胞增殖或凋亡。研究表明，miR-214可靶向下調環(huán)氧化酶(COX-2)抑制前列腺素E2的表達，減弱硫酸吲哚酚引起的內皮細胞凋亡[16]。在DKD腎纖維化進程中，內皮細胞發(fā)生EndMT的同時，腎小管上皮細胞也會受病理刺激發(fā)生表型轉化。本研究團隊曾證實，由成纖維生長因子受體缺陷介導的內皮細胞EndMT可誘導相鄰腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間充質轉化(EMT)[17]。因此，如何阻止腎臟發(fā)生EMT也是眾多研究者們關注的難題。Bera等[18]在糖尿病小鼠的腎皮質及高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞中發(fā)現(xiàn)miR-214表達增加，用PTEN的3′-UTR構建報告基因進行突變研究，確定PTEN為miR-214的直接靶標；抑制miR-214的表達可恢復SM22、α2SMA和Ⅳ型膠原纖維的表達，恢復PTEN水平，改善DKD引起的腎小球肥大。

盡管未得到完全證實，以上實驗結果均提示DKD中上調的miR-214可能通過靶向調控PTEN信號通路促進腎臟EndMT纖維化，同時miR-214可調控COX-2介導的內皮細胞氧化應激失活，失活帶來的細胞功能紊亂也會引起EndMT的發(fā)生，為miR-214的促纖維化作用機制提供了理論依據(jù)。

3 miR-125b

miR-125b在心肌纖維化中研究較為廣泛。研究表明，心肌發(fā)生纖維化時，EndMT轉化而來的成纖維細胞的miR-125b表達水平是心臟內皮細胞的4倍；miR-125b靶向結合抗纖維化基因p53的3′-UTR，促進心臟EndMT和成纖維細胞增殖活化[19]。Silambarasan等[20]利用高糖誘導內皮細胞功能障礙與細胞凋亡模擬糖尿病條件下的血管損傷，進行miRNA差異性分析，結果顯示miR-125b-1-3p隨葡萄糖濃度增加而上調。

Muramatsu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在低氧或VEGF刺激的內皮細胞中表達明顯升高；miR-125b直接與內皮細胞標志物VE-Cadherin mRNA的3′-UTR結合抑制其翻譯，影響血管形成。這一結果提示在低氧和細胞因子刺激下，miR-125b可能存在促纖維化作用。長期的高糖環(huán)境會使內皮細胞持續(xù)受損，炎癥因子高水平表達。Zhong等[22]在高糖培養(yǎng)的內皮細胞中進行miRNA差異表達分析，發(fā)現(xiàn)表達上調的miR-125b與TNF-α誘導蛋白3(TNFAIP3)的3′-UTR存在結合位點；TNFAIP3通過拮抗激活復合物成分中的K63連接泛素化抑制NF-κB信號，表明miR-125b通過對NF-κB抑制劑TNFAIP3的沉默作用，可間接增加NF-κB表達，促進由后者介導的EndMT進程。

多項研究結果表明，內皮細胞miR-125b水平與葡萄糖含量成正比，miR-125b一方面直接抑制VE-Cadherin的表達，內皮細胞黏附作用被破壞，血管無法維持其通透性；另一方面，miR-125b通過抑制NF-κB、阻遏蛋白活性，間接增強相關信號通路，細胞更容易發(fā)生纖維化。

4 miR-217

miR-217位于人類基因組2號染色體，通過不同機制參與腫瘤的增殖、轉移、侵襲和耐藥[23]。Shao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，糖尿病患者血清中miR-217表達明顯升高，且miR-217水平與糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)、尿蛋白/肌酐比值、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、低氧誘導因子1α(HIF-1α)和VEGF表達呈正相關，與抗衰老因子沉默信息調節(jié)因子1(Sirt1)表達呈負相關，提示miR-217反映糖尿病患者血糖和抗胰島素水平的同時，可能通過參與炎癥、氧化應激、纖維化和血管生成，影響DKD的發(fā)生發(fā)展。

有學者發(fā)現(xiàn)，Sirt1是miR-217的靶基因，miR-217可通過Sirt1基因3′-UTR中的結合位點抑制Sirt1表達，使內皮細胞功能退化和提前衰老，最終導致血管生成受損[25]。研究證實，Sirt1可通過抑制Smad3的乙?；?，參與TGF-β/Smad介導的腎纖維化過程[26]。以上結果提示，miR-217/Sirt1/TGF-β/Smad信號轉導通路對EndMT有正向調控作用。與此同時，很多研究表明，miR-217在其他腎臟來源細胞中也表現(xiàn)出促纖維化作用。Shao等[27]發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，miR-217在腎小球系膜細胞中表達水平升高，同時伴隨Sirt1表達下調和HIF-1α及其下游纖維化因子的生成，從而促進DKD的炎癥和纖維化。足細胞的損傷在DKD中發(fā)揮關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-217可恢復腫瘤壞死因子超家族成員11誘導的腎足細胞凋亡，緩解DKD[28]。但也有學者在其他纖維化細胞模型中得出不同的實驗結論。如Gao等[29]的報告顯示，在TGF-β誘導氣道平滑肌細胞增殖和遷移的模型中，miR-217表達下調，而過表達miR-217可抑制TGF-β刺激的細胞增殖、遷移和ECM沉積；結合生物信息學分析、熒光素酶活性檢測和RNA蛋白檢測結果，證實了纖維化轉錄抑制因子E盒結合鋅指蛋白1的3′-UTR是miR-217的潛在靶標。

以上研究表明，盡管miR-217在不同腎臟細胞中可能呈現(xiàn)差異性表達，但與高血糖及DKD密切相關，并且可能參與調控DKD狀態(tài)下的EndMT，其具體機制還需進一步探討。

5 miR-155

miR-155高表達可導致多種惡性腫瘤治療耐藥及不良預后[30]。Beltrami等[31]發(fā)現(xiàn)，與沒有DKD表現(xiàn)的糖尿病對照組比較，DKD患者尿液樣本中miR-155明顯升高，miR-155診斷DKD具有較高的特異性及敏感性。

現(xiàn)已證實，腎纖維化調節(jié)因子c-ski可與Smad蛋白的Mad同源域2結合，阻止Smad被激活，減弱TGF-β/Smad信號活性。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)，miR-155可直接靶向c-ski的3′-UTR，抑制c-ski表達；抑制miR-155可恢復TGF-β誘導的細胞EndMT。另外，Chen等[33]研究顯示，內皮細胞中Akt1的3′-UTR與miR-155-5p之間存在結合位點，miR-155-5p參與PI3K/Akt信號通路調控。含Src同源性2域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP-1)可將PIP3去磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸，有效終止PI3K途徑的下游信號轉導。Tang等[34]發(fā)現(xiàn)，SHIP-1是miR-155的作用靶點，miR-155下調SHIP-1表達，參與博來霉素治療產生的EndMT，涉及到的機制包括PI3K/Akt、JAK/STAT3和Smad/STAT等信號通路。

根據(jù)以上實驗結果可知，miR-155與DKD存在密切關聯(lián)，可作為DKD診斷及病情監(jiān)測的有效指標。miR-155從多途徑參與EndMT進程，包括抑制內皮細胞增殖、遷移，調控TGF-β/Smad和PI3K/Akt等典型EndMT激活通路等。同時，miR-155也是常見的致癌性miRNA，若代謝調節(jié)出現(xiàn)紊亂，會增加多種疾病的發(fā)病率。

6 miR-433

miR-433在多種惡性腫瘤中表達下調，通過抑制腫瘤細胞增殖和遷移發(fā)揮抑癌作用[35]。miR-433還可以靶向COX-2保護胰島β細胞免受高糖刺激引起的細胞損傷[36]。然而，在DKD腎纖維化過程中，miR-433卻表現(xiàn)為負面作用。Zhu等[37]在鏈脲佐菌素誘導的DKD大鼠腎組織中觀察到miR-433表達上調。

有研究表明，miR-433通過對抑制抗酶抑制因子1(Azin1)活性的抑制形成正反饋回路，放大TGF-β/Smad3信號轉導驅動的腎纖維化[38]。γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)是催化抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)合成的關鍵酶，當GSH穩(wěn)態(tài)改變時，內皮細胞受到活性氧(ROS)的刺激，發(fā)生功能障礙和EndMT。有學者利用生物信息學分析確定miR-433為靶向GCLc和GCLm基因3′-UTR的候選miRNA，在內皮細胞中上調miR-433表達觀察到GCL、GSH表達下降，細胞氧化應激增強，提示miR-433特異性參與GCL的激活影響GSH合成，拮抗miR-433可抑制GCL活性，緩解TGF-β依賴的腎纖維化[39]。

以上研究表明，miR-433在促進DKD腎纖維化的同時，對高糖誘導的細胞氧化應激也有一定刺激作用，細胞內ROS大量積累直接影響線粒體供能，導致細胞代謝紊亂，進而導致細胞失活。

7 miR-342

miR-342是一種與肥胖相關的miRNA，其過表達會引起代謝紊亂。Wang等[40]發(fā)現(xiàn)DKD患者體內miR-342特異性表達上調。有學者用TGF-β誘導內皮細胞EndMT，發(fā)現(xiàn)miR-342-5p的表達水平明顯升高。內皮糖蛋白(ENG)作為TGF-β信號通路的共受體，可以激活Smad1/5磷酸化，抑制Smad2/3活化，ENG基因的3′-UTR為miR-342的直接靶標；實驗還發(fā)現(xiàn)，miR-342-5p抑制內皮細胞中VEGF受體(VEGFR)活性，減弱VEGF誘導的Akt磷酸化[41]。這提示miR-342-5p可通過抑制VEGFR和ENG參與TGF-β信號轉導，減少內皮細胞增殖、遷移，增加EndMT發(fā)生的可能。

8 miR-199a

miR-199a存在兩種形式，分別為miR-199a-3p和miR-199a-5p，這兩種miRNA分別調節(jié)各種細胞的活性，參與相應的生理病理過程。有學者發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，miR-199a在糖尿病患者血漿中表達明顯升高[42]。微囊蛋白1(CAV1)作為一種膜內蛋白，可通過調節(jié)c-Jun N端激酶途徑抑制TGF-β誘導的成纖維細胞ECM，發(fā)揮抗增殖、抗纖維化作用。有實驗人員利用輻射誘導內皮細胞發(fā)生EndMT，發(fā)現(xiàn)纖維化因子Snail被激活。而miR-199a-5p作為Snail的下游介質，可直接靶向成纖維細胞中CAV1基因的3′-UTR，參與纖維化過程[44,45]。與其他miRNA不同，miR-199a抑制內皮細胞和成纖維細胞同時具備的CAV1，一方面影響內皮細胞膜過濾作用，促進DKD蛋白尿；另一方面影響成纖維細胞的增殖，促進腎纖維化。

綜上所述，在DKD中表達上調的miRNA，在DKD腎纖維化病程中起到重要的調節(jié)作用，其可能依賴于經典的TGF-β信號通路或其他非典型信號通路調控EndMT的發(fā)生發(fā)展。DKD的發(fā)病機制復雜，臨床治療效果不理想，miRNA檢測有助于反映疾病的嚴重程度，而且，基于miRNA的靶向治療可以提供新的治療策略，脂質體或納米顆粒等新的載體可以有效控制劑量及不良反應，有效延緩腎纖維化進程。盡管EndMT的具體機制有待闡明，miRNA在DKD靶向治療中的應用也面臨著巨大挑戰(zhàn)，但隨著大量體內外實驗及臨床樣本分析的出現(xiàn)，我們將進一步了解miRNA與EndMT、腎纖維化之間的聯(lián)系，為腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展和預后評估提供更多的證據(jù)支撐。