三種TRACP染色法檢測(cè)CIA大鼠關(guān)節(jié)切片中破骨細(xì)胞的比較

徐慧慧，劉 紅，李 艷，潘靜華，王少君，曹金鳳，趙宏艷

破骨細(xì)胞屬于組織特異性的多核巨噬細(xì)胞，來源于骨髓造血單核巨噬細(xì)胞系，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)及其繼發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRACP)是破骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志物，也與破骨細(xì)胞骨吸收功能密切相關(guān)[1-2]。應(yīng)用TRACP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞分化及觀察破骨細(xì)胞活性是實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)之一，TRACP染色方法較多，多采用酸性磷酸酶試劑盒檢測(cè)。本課題組前期進(jìn)行體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞采用該試劑盒染色，破骨細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色，染色清晰，染色效果理想[3]。但組織切片采用該方法則背景偏黃，對(duì)比度不高，體積較小的破骨細(xì)胞及其前體難以辨認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)以RA的經(jīng)典模型——膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠關(guān)節(jié)石蠟切片為觀察對(duì)象，采用三種TRACP染色方法分析破骨細(xì)胞的表達(dá)，以期尋找一種染色效果好、穩(wěn)定性強(qiáng)且性價(jià)比高的染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料 正常大鼠和CIA大鼠關(guān)節(jié)石蠟切片。

1.1.2試劑 萘酚AS-MX磷酸鹽、N，N-二甲基甲酰胺、快紅TR鹽、氯化亞錳、酒石酸鈉、固紅紫色LB鹽、酸性磷酸酶試劑盒，均購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法(1)以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色方法[4]：染液配制0.1 mol/L Tris孵育液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸鹽，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L快紅TR鹽、0.5 mmol/L氯化亞錳和25 mmol/L酒石酸鈉。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育40 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封片。光鏡下觀察，并拍照分析。(2)以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法[5]:孵育液配制0.1 mol/L Tris緩沖液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸鹽，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L固紅紫色LB鹽和25 mmol/L酒石酸鈉。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育15 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封固。光鏡下觀察，并拍照分析。(3)酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法[6]：染液的配制取0.5 mL固深紅GBC與0.5 mL亞硝酸鈉溶液混勻，靜置2 min，然后加入預(yù)熱去離子水45 mL、0.5 mL萘酚AS-BI、2 mL醋酸溶液、1 mL酒石酸鹽溶液。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育45 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封固。光鏡下觀察，并拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠和CIA大鼠關(guān)節(jié)切片中破骨細(xì)胞的表達(dá)大鼠關(guān)節(jié)組織切片經(jīng)TRACP染色后，破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體胞質(zhì)酶活性部位可見有不溶性紫紅色顆粒樣沉淀。典型的破骨細(xì)胞體積較大，含有多核，形態(tài)不規(guī)則。

正常大鼠滑膜組織和骨髓組織中TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞少見；而在CIA大鼠增生的滑膜組織中可見有大小不一、深淺不同的TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞。此外，在CIA大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨和股骨的骨骺及骨干的髓腔內(nèi)，也可見TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，多位于骨小梁邊緣。若關(guān)節(jié)軟骨被滑膜侵蝕，則骨骺端內(nèi)TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞明顯增多(圖1)。

圖1 正常大鼠與CIA大鼠關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞的表達(dá)，TRACP染色：A.正常大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，藍(lán)色箭頭示軟骨組織；B.CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，綠色箭頭示破骨細(xì)胞，黃色箭頭示骨組織；C.正常大鼠膝關(guān)節(jié)骨髓組織，黃色箭頭示骨組織；D.CIA大鼠膝關(guān)節(jié)骨髓組織，綠色箭頭示破骨細(xì)胞，黃色箭頭示骨組織

2.2 三種TRACP染色法對(duì)CIA大鼠滑膜組織中破骨細(xì)胞表達(dá)的影響采用三種TRACP法染色，CIA大鼠關(guān)節(jié)切片滑膜組織均可見TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，但表達(dá)強(qiáng)度和染色效果明顯不同，其中檢測(cè)效果較為理想的是以快紅TR鹽為顯色劑和以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法。與酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法相比，前兩種方法染色的切片背景著色淺，且可以檢測(cè)較小的破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體(圖2)。

圖2 CIA大鼠滑膜組織中破骨細(xì)胞的表達(dá)：A.以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞；B.以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞；C.酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞 圖3 CIA大鼠骨髓組織中破骨細(xì)胞的表達(dá)：A.以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞；B.以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞；C.酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細(xì)胞

2.3 三種TRACP染色法對(duì)CIA大鼠骨髓組織中破骨細(xì)胞表達(dá)的影響經(jīng)三種方法染色后，CIA大鼠關(guān)節(jié)切片骨髓組織均可見TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，但表達(dá)程度和染色效果明顯不同。與滑膜組織切片染色結(jié)果相似，以快紅TR鹽為顯色劑和以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法的檢測(cè)效果更為理想；與酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法相比，前兩種染色的切片背景著色淡，且可以檢測(cè)到較小的破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體?？旒tTR鹽為顯色劑的TRACP法染色的靈敏度優(yōu)于固紅紫色LB鹽為顯色劑的染色法(圖3)。

3 討論

RA的主要特征是關(guān)節(jié)滑膜炎癥和軟骨、骨的進(jìn)行性破壞，骨質(zhì)破壞及由此產(chǎn)生的功能障礙是RA致殘的主要原因。多種細(xì)胞參與該過程[7]，而破骨細(xì)胞的過度活化、增殖在RA骨破壞進(jìn)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RA病灶部位有大量成熟的破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體[8-9]，其過度增殖和異?；钴S打破骨代謝平衡，使骨吸收占優(yōu)勢(shì)，從而完成了由滑膜炎癥到骨質(zhì)破壞的病理轉(zhuǎn)變。因此，鑒定破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能在RA及其他代謝性骨病的研究中具有重要意義。

當(dāng)破骨細(xì)胞分化成熟時(shí)，胞質(zhì)中可產(chǎn)生大量的TRACP，因此在病理診斷中可以用TRACP染色法檢測(cè)破骨細(xì)胞。TRACP染色原理：染色孵育液是以萘酚磷酸鹽作為底物，以快紅TR鹽、固紅紫色LB鹽、六偶氮副品紅等作為顯色劑。當(dāng)酒石酸鈉存在酸性條件下，萘酚磷酸鹽經(jīng)酸性磷酸酶水解可以釋放磷酸和萘酚，萘酚與顯色劑偶聯(lián)從而形成不溶性染料，紅色染料沉積在胞質(zhì)中含有TRACP的酶活性部位。

酸性磷酸酶試劑盒是實(shí)驗(yàn)中常用的快速檢測(cè)破骨細(xì)胞的方法，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞采用該試劑盒染色，破骨細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色，染色清晰，染色效果理想。但組織切片采用該試劑盒染色后，切片背景色偏黃，對(duì)比度差，破骨細(xì)胞輪廓不清晰，或體積較小的破骨細(xì)胞難以辨認(rèn)。為提高染色效果，本實(shí)驗(yàn)以CIA大鼠關(guān)節(jié)石蠟切片為分析對(duì)象，觀察三種TRACP法在破骨細(xì)胞中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示：三種染色方法組織切片中均可見TRACP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，其中檢測(cè)效果最為理想的是快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，該方法染色背景色淡染，破骨細(xì)胞清晰，可見體積較小的破骨細(xì)胞。試劑盒染色后，切片背景色偏黃，對(duì)比度差。以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法也取得了較好的染色效果，但綜合考慮實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)(顯色劑固紅紫色LB鹽價(jià)格明顯高于快紅TR鹽)等原因，我們推薦以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法用于組織切片中破骨細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞三種染色方法均可，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)自行選擇。

TRACP染色時(shí)應(yīng)注意染色孵育液需現(xiàn)用、現(xiàn)配，孵育液的pH值可以影響酶的活性，對(duì)染色效果影響較大，本實(shí)驗(yàn)采用pH 5.0的染色液取得了較好的效果。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]染液pH值為5.0～5.2時(shí)，染色背景常有顆粒沉渣，經(jīng)蒸餾水水洗易脫片；本實(shí)驗(yàn)無此現(xiàn)象，可能與實(shí)驗(yàn)試劑及切片的黏附方式不同有關(guān)。此外，染色液孵育時(shí)間也需要根據(jù)樣品進(jìn)行調(diào)整，如小鼠樣品切片可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。