利用桿狀病毒實(shí)現(xiàn)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

鄒桂蓮，羅青平，邵華斌，溫國元，楊 燁，商 雨

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽病原微生物學(xué)湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2. 長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

桿狀病毒是一類專職感染無脊椎動(dòng)物的病毒，病毒呈桿狀，具有囊膜。在其生活周期中共產(chǎn)生兩種形態(tài)不一的病毒粒子，出芽型病毒粒子和包埋型病毒粒子，分別負(fù)責(zé)病毒的口服感染和系統(tǒng)感染兩個(gè)環(huán)節(jié)［1］。桿狀病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，大小為80～180 kb，編碼150 多個(gè)病毒蛋白。桿狀病毒分為4 個(gè)病毒屬：甲型、乙型、丙型和丁型［2］。

桿狀病毒是目前應(yīng)用最廣泛的病毒之一。作為安全、高效的生物殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)病蟲害的防治［3，4］；作為表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)［5，6］；作為潛在的基因治療載體將藥物基因帶入到靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)并實(shí)現(xiàn)表達(dá)［7，8］。早期，由于桿狀病毒的基因組較大且不易操作，構(gòu)建重組桿狀病毒是將桿狀病毒的基因組和外源基因片段一起轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞內(nèi)，通過同源重組的方法將外源基因替換到病毒基因組上，從而獲得重組桿狀病毒［9］。隨后，為了提高重組桿狀病毒的構(gòu)建效率，將桿狀病毒的基因組線性化后，再與外源基因片段一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，很大程度提高重組效率。Luckow 等［10］將細(xì)菌的復(fù)制子插入到桿狀病毒基因組里，構(gòu)建成能在細(xì)菌里復(fù)制的桿狀病毒基因組—— 桿粒（bacmid）；且在細(xì)菌里還可以通過轉(zhuǎn)座的方法將外源基因定點(diǎn)插入到bacmid 上，獲得重組桿狀病毒基因組。以該方法開發(fā)成的Bac-to-Bac 重組桿狀病毒快速構(gòu)建系統(tǒng)被迅速推廣和應(yīng)用，成千上萬的蛋白被該系統(tǒng)表達(dá)。

桿狀病毒作為表達(dá)系統(tǒng)有很多顯著的優(yōu)勢(shì)：①基因組的容量大，可以攜帶較大的外源基因或多個(gè)外源基因［11］；②在昆蟲細(xì)胞內(nèi)或昆蟲體內(nèi)表達(dá)蛋白，比原核表達(dá)系統(tǒng)有更好的翻譯后修飾系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白更接近天然結(jié)構(gòu)［12］；③桿狀病毒部分基因的啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)；④系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，重組桿狀病毒構(gòu)建效率高。但是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也存在一些不足之處：①桿狀病毒的基因組較大，編碼的病毒蛋白較多，對(duì)細(xì)胞的毒性較大；②桿狀病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子都屬于晚期啟動(dòng)子，基因表達(dá)滯后，細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的積累導(dǎo)致外源蛋白的正確折疊受到影響［13］；③昆蟲細(xì)胞的翻譯后修飾，尤其是糖基化修飾，與哺乳動(dòng)物等高等生物細(xì)胞有差異，不利于特殊蛋白（如糖蛋白）的表達(dá)［14］。

本研究旨在對(duì)桿狀病毒進(jìn)行改造，使之能在哺乳動(dòng)物或其他高等生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因，從而克服桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的不足之處，更大程度地提高表達(dá)蛋白的翻譯后修飾。另外，也可以將桿狀病毒作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，開發(fā)新型、高效的基因治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR 酶2×Phanta Max Master Mix（Dye PLus）和T4 DNA 連接酶購自Vazyme 公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega 公司；限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoR I、Xba I 和Sph I 均購自TaKaRa 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒QIAGENPlasmid Mini Kits 購 自QIAGEN 公 司；Insect Cell Culture Medium（貼壁）購自NovaStar 公司；Aus-GeneX 澳洲特級(jí)胎牛血清購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑購自Gibco 公司；硫酸慶大霉素（Gentamycin sulfate，Gen）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、鏈霉素（Streptomycin，Str）、四環(huán)素（Tet）、IPTG 溶液和Xgal 溶液均購自Solarbio 公司。

1.1.2 病毒基因、載體和細(xì)胞 pcDNA3.1、pcDNAmCherry、pFastBac-Dual 質(zhì)粒、pTS09-C-egfp 和Sf9昆蟲細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。哺乳動(dòng)物DNA 從BHK-21 細(xì)胞中提取。DH5α 感受態(tài)購自大連TaKa-Ra 公司。含有桿狀病毒基因組（AcBac-Δcc）和helper 質(zhì)粒的BW25113 大腸桿菌菌株由本試驗(yàn)制備。

1.2 方法

1.2.1 CMV 啟動(dòng)子（PCMV）和EF1 啟動(dòng)子（PEF1）的克隆 根據(jù)PCMV序列和PEF1序列設(shè)計(jì)引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pcDNA3.1 為模板，用引物對(duì)PCMV-F 和PCMV-R 擴(kuò)增PCMV；以哺乳動(dòng)物DNA 為模板，用引物對(duì)PEF1-F 和PEF1-R 擴(kuò)增PEF1。通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳回收PCMV和PEF1擴(kuò)增產(chǎn)物。PCMV和PEF1片段通過Overlapping PCR 融合形成PCMV-PEF1片段，通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2.2 重組表達(dá)載體pFastBac-2EP 的構(gòu)建 分別用XhoI 和EcoR I 雙酶切PCMV-PEF1和pFastBac-Dual，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。10 μL T4 DNA 連接酶體系中，按摩爾比（3～10）∶1 加入回收后的目的片段和載體，在4 ℃連接過夜。取5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μL DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL 菌液涂布于含Amp（10 μg/mL）和Gen（10 μg/mL）的LB 營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)，利用引物PCMV-F 和PEF1-R 對(duì)菌液進(jìn)行PCR 檢測(cè)，提取陽性菌液的質(zhì)粒，命名為pFastBac-2EP，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建根據(jù)mCherry 和egfp 基因序列分析，設(shè)計(jì)引物對(duì)（EGFP-F、EGFP-R）和引物對(duì)（mCherry-F、mCherry-R）（表1），以pcDNA-mCherry 和PTS09-C-egfp為模板，擴(kuò)增mCherry 和egfp 基因序列。通過酶切和連接的方法，先后將egfp 和mCherry 基因插入到pFastBac-2EP 質(zhì)粒PEF1下游的EcoR I 和Xba I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間和PCMV下游的Xho I 和Sph I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，培養(yǎng)至長出單菌落后挑取單菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)。經(jīng)PCR 鑒定和酶切鑒定后，挑選構(gòu)建正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pFastBac-2EP-mCherry-egfp（圖1）。

1.2.4 重組質(zhì)粒pAc-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建取50 ng 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BW25113 株感受態(tài)細(xì)胞（含AcBac-Δcc bacmid 和helper 質(zhì)粒），菌液涂布于LB 平板（含Kan 50 μg/mL；Tet 50 μg/mL；Gen 10 μg/mL；IPTG 48 μg/mL 和X-gal 80 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)，通過PCR 鑒定外源基因是否插入到桿狀病毒基因組上。使用引物對(duì)Gen-F 和LacZ-R 以及引物對(duì)LacZ-F 和PEF1-R 來進(jìn)行檢測(cè)（表1），其中引物L(fēng)acZ-F 和LacZ-R 位于桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)座位點(diǎn)兩側(cè)，引物Gen-F 和PEF1-R 位于pFastBac-2EP-mCherry-egfp 質(zhì)粒上。檢測(cè)陽性的重組桿狀病毒基因組命名為pAc-2EPmCherry-egfp。用QIAGENPlasmid Mini Kits 試劑盒提取重組桿狀病毒基因組。

1.2.5 重組病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 的拯救六孔板中Sf9 細(xì)胞生長至70%～80% 時(shí)，根據(jù)Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑說明書，將5 μg pAc-2EP-mCherryegfp 重組桿狀病毒基因組DNA 轉(zhuǎn)染到Sf9 細(xì)胞，置于27 ℃培養(yǎng)箱孵育4～5 d，每天觀察細(xì)胞病變。收取培養(yǎng)上清，5 000 r/min 離心5 min，去除細(xì)胞碎片。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液繼續(xù)感染Sf9 細(xì)胞，獲得高滴度的重組桿狀病毒命名為rAc-2EP-mCherryegfp。

1.2.6 重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞 六孔板中每孔鋪入106Sf9 細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，重組桿狀病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 以1 MOI的感染劑量感染Sf9 細(xì)胞。27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，每天觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光和綠色熒光的產(chǎn)生情況。

六孔板中每孔鋪入2×105BHK-21 細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，重組桿狀病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 以10 MOI 的感染劑量感染BHK-21 細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光和綠色熒光的產(chǎn)生情況。

圖1 Donor 質(zhì)粒構(gòu)建流程

2 結(jié)果與分析

2.1 donor質(zhì)粒pFastBac-2EP 的構(gòu)建

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增出來的片段PCMV和PEF1大小分別位于250～500 bp 和500～750 bp，與片段預(yù)期的大小（分別為375 和574 bp）相符。再通過Overlapping PCR 將PCMV和PEF1融合在一起獲得大小為750～1 000 bp 的片段PCMV-PEF1（圖2A），大小與預(yù)期大小（946 bp）相符。將PCMV-PEF1插入到pFast-Bac-Dual 質(zhì)粒的XhoI 和EcoR I 酶切位點(diǎn)后，獲得改造的donor 質(zhì)粒pFastBac-2EP，質(zhì)粒PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（圖2B 和圖2C）均表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。進(jìn)一步將質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入片段沒有發(fā)生點(diǎn)突變。因此該donor 質(zhì)粒可用于下游試驗(yàn)。

圖2 啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果和pFastBac-2EP 構(gòu)建的鑒定結(jié)果

2.2 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建

圖3 質(zhì)粒pFastBac-2EP-mCherry-egfp 構(gòu)建過程中的電泳

根據(jù)所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增mCherry 和egfp 基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到711 和729 bp 的兩條條帶（圖3A），條帶大小與預(yù)期相符。將目的片段mCherry 和egfp 片段通過酶切連接的方法分別插入PCMV和PEF1下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Xho I 和Sph I 以及EcoR I 和Xba I 分別對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，表明酶切樣品均能產(chǎn)生2 條條帶（圖3B），大小與預(yù)期結(jié)果相符合。將鑒定正確的質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示插入序列沒有發(fā)生突變，表明pFastBac-2EP-mCherry-egfp 構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒pAc-2EP-mCherry-egfp 的構(gòu)建

將pAc-2EP-mCherry-egfp 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BW25113 株感受態(tài)細(xì)胞（含AcBac-Δcc bacmid 和helper 質(zhì)粒）中，經(jīng)Blue-Gal 藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)。 用引物Gen-F 和LacZ-R 以及LacZ-F 和PEF1-R 兩組引物進(jìn)行菌液PCR 鑒定，兩組引物擴(kuò)增的片段大小分別為750 和1 200 bp 左右（圖4），擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組桿狀病毒基因組構(gòu)建正確。

圖4 重組桿狀病毒基因組鑒定結(jié)果

2.4 重組病毒的拯救

將重組桿狀病毒基因組pAc-2EP-mCherryegfp 轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞。72 h 后觀察到細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹以及細(xì)胞核膨脹，96 h 后大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變，120 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液感染Sf9 細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞的病變。結(jié)果表明，感染后48 h 細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，96 h 后大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的桿狀病毒病變（圖5）。收集病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，病毒滴度達(dá)到1.8×108TCID50/mL。

圖5 重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞的病變觀察

2.5 重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞和BHK-21 細(xì)胞

用1 MOI 重組病毒rAc-2EP-mCherry-egfp 感染Sf9 細(xì)胞，觀察熒光變化情況。病毒在感染24 h后出現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光，但熒光較暗，隨后熒光慢慢增強(qiáng)；96 h 后，紅色熒光和綠色熒光強(qiáng)度非常高（圖6A 和圖6B）。用10 MOI 重組病毒rAc-2EPmCherry-egfp 轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21 細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)，48 h 開始出現(xiàn)微弱的綠色和紅色熒光，隨后熒光逐漸增強(qiáng)；120 h 后，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)的非常高（圖6C 和圖6D），表明桿狀病毒可以進(jìn)入BHK-21 細(xì)胞，且PCMV和PEF1可作為桿狀病毒表達(dá)載體的啟動(dòng)子在Sf9 細(xì)胞和BHK-21 細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)蛋白。

圖6 rAc-2EP-mCherry-egfp 感染Sf9 細(xì)胞和BHK-21 細(xì)胞的熒光

3 小結(jié)與討論

桿狀病毒作為一種安全、高效的表達(dá)載體，應(yīng)用越來越廣泛，但是由于桿狀病毒感染宿主細(xì)胞會(huì)大量合成病毒蛋白和組裝桿狀病毒，導(dǎo)致細(xì)胞快速凋亡，以及糖基化修飾方式與其他的高等生物細(xì)胞不一致，極大影響了蛋白表達(dá)產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)和功能，提高了純化難度［15］。為了解決這些問題，研究者們也采取了系列措施，如精簡(jiǎn)桿狀病毒基因組［16］、攜帶抑制細(xì)胞凋亡的基因［17］和引入其他高等生物細(xì)胞的糖基化修飾系統(tǒng)［18］，對(duì)改良桿狀病毒的應(yīng)用起到一定作用。本研究旨在構(gòu)建一個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白的重組桿狀病毒，可以禁止桿狀病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，不會(huì)引起細(xì)胞病變的產(chǎn)生，還可以利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)。

因?yàn)闂U狀病毒具有強(qiáng)大的膜融合蛋白（GP64），能介導(dǎo)桿狀病毒與多物種的細(xì)胞發(fā)生膜融合，將桿狀病毒的核衣殼轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在不同細(xì)胞上的差異較大［19］。桿狀病毒的啟動(dòng)子一般不會(huì)被其他物種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別，因此首先替換了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子，將表達(dá)載體中的p10 和PH 啟動(dòng)子替換成CMV 和EF1 基因的啟動(dòng)子。這兩種啟動(dòng)子均被廣泛應(yīng)用于各種真核表達(dá)載體的構(gòu)建。為了驗(yàn)證改造后的啟動(dòng)子能否發(fā)揮作用，分別將紅色熒光蛋白mCherry 基因和綠色熒光蛋白egfp 基因插入到CMV 和EF1 啟動(dòng)子下游，然后經(jīng)過轉(zhuǎn)座構(gòu)建重組桿狀病毒基因組，再經(jīng)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，獲得重組桿狀病毒。重組桿狀病毒在感染Sf9 昆蟲細(xì)胞時(shí)，可以產(chǎn)生紅色和綠色熒光，表明CMV 和EF1 啟動(dòng)子可以在昆蟲細(xì)胞內(nèi)工作；當(dāng)重組桿狀病毒孵育BHK-21 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞在48 h后才開始產(chǎn)生熒光，隨后熒光強(qiáng)度才逐漸變強(qiáng)，桿狀病毒可以將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入BHK-21 細(xì)胞，且CMV 和EF1 啟動(dòng)子可以在BHK-21 細(xì)胞內(nèi)持續(xù)工作。后期將在此基礎(chǔ)上，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和家禽細(xì)胞系進(jìn)行篩選，選擇適合的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系；另外還將從提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和入核效率等方面對(duì)桿狀病毒載體進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高桿狀病毒載體的應(yīng)用性能。