枯草期放牧東寶黑頭羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)及瘤胃細(xì)菌多樣性分析

張 年，楊前平，陶 虎，熊 琪，李曉鋒，陳明新，索效軍

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

反芻動物的瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，棲居有大量的細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和原蟲，這些微生物可將植物性纖維轉(zhuǎn)化為反芻動物能量，適宜的微生物群落環(huán)境對維持宿主營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、生產(chǎn)性能及健康免疫至關(guān)重要［1］。細(xì)菌是反芻動物瘤胃中數(shù)量最多、種類最復(fù)雜的微生物，它們的生長代謝活動能夠?yàn)閯游锾峁┠芰?、蛋白質(zhì)、必需氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)［2］。細(xì)菌受多種生理、飼料、環(huán)境等因素影響，而飼料是最主要的影響因素［3］，放牧山羊的營養(yǎng)來源主要是天然牧草，牧草質(zhì)量可影響瘤胃中微生物種類及瘤胃內(nèi)環(huán)境［4］，因此，揭示放牧條件下瘤胃微生物的差異，有助于了解粗飼料影響動物健康和生產(chǎn)性能的機(jī)理，亦可為飼用微生物的開發(fā)和提高牧草利用率提供依據(jù)。

東寶黑頭羊是以波爾山羊?yàn)楦副?，麻城黑山羊?yàn)槟副?，采用?dǎo)入雜交方法，歷經(jīng)10 余年培育的一個(gè)“黑頭白身”新類群，主要飼養(yǎng)于湖北省西北部低丘崗地、江漢平原地區(qū)，以放牧為主，具有耐粗飼、耐濕熱、性早熟等優(yōu)點(diǎn)。目前對于東寶黑頭羊的研究主要集中于資源調(diào)查及營養(yǎng)調(diào)控上，而對于瘤胃內(nèi)環(huán)境調(diào)控及細(xì)菌多樣性的研究鮮有報(bào)道。高通量測序技術(shù)已被廣泛用于微生物生態(tài)學(xué)研究，其可全面客觀地反映樣品微生物的結(jié)構(gòu)與組成。本試驗(yàn)擬對枯草期放牧東寶黑頭羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)及瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，以期為揭示瘤胃細(xì)菌的調(diào)控機(jī)制和探索科學(xué)的補(bǔ)飼方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年12 月在湖北省荊門市崗東菀畜牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社進(jìn)行，該地區(qū)屬亞熱帶溫暖季風(fēng)型氣候，年降水量為949.4 mm，平均海拔150 m，年平均氣溫16.1℃，牧草生長期235 d 左右，一般11月開始枯黃，草地類型為湖濱草甸草場，優(yōu)質(zhì)牧草占地上生物量的比例為45%～50%，草地主要優(yōu)勢種為芒（Miscanthus sinensis）、白茅（Imperata cylindrica）、白羊草（Bothriochloa ischaemum）、假儉草（Eremochloa ophiuroides）等，伴生種為地榆（Sanguisorba officinalis）、委陵菜（Potentilla chinensis）、雞眼草（Kummerowia striata）等。

選取6 只體重為（45.24±1.25）kg 的2 歲健康東寶黑頭羊（公母各半）佩戴耳標(biāo)，在荊門市東寶區(qū)湖濱草甸草場進(jìn)行放牧。試驗(yàn)期間自由飲水、無補(bǔ)飼處理。

1.2 樣品采集

1.2.1 牧草采集 分別將試驗(yàn)樣地劃分10 個(gè)樣方（0.5 m× 0.5 m），采集樣方中混合牧草地上生物量，除去不可食部分，將原始樣品剪碎，于烘箱中65 ℃烘至恒重，粉碎過篩進(jìn)行牧草營養(yǎng)成分的測定。

1.2.2 瘤胃液采集 按照耳標(biāo)序號在上午放牧前，經(jīng)口腔插管采集瘤胃液，每只羊采集瘤胃液40 mL，用4 層滅菌紗布進(jìn)行過濾，立即進(jìn)行瘤胃液pH 的測定，取約20 mL 用于氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）含量的測定，20 mL 備用，其中2 mL 用來進(jìn)行DNA 的提取，分裝完畢后立即貯存到液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.3 樣品測定

1.3.1 牧草營養(yǎng)成分 參考標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行測定，其中干物質(zhì)按GB/T 6435—2014 進(jìn)行測定、粗蛋白質(zhì)按GB/T 6432—2018 進(jìn)行測定、粗脂肪按GB/T 6433—2006 進(jìn)行測定、鈣按GB/T 6436—2002 進(jìn)行測定、磷按GB/T 6437—2002 進(jìn)行測定、酸性洗滌纖維按NY/T 1459—2007 進(jìn)行測定、中性洗滌纖維按GB/T 20806—2006 進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表1。

表1 枯草期牧草常規(guī)營養(yǎng)成分含量 （單位：%）

1.3.2 瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù) 瘤胃液pH 采用pHS-3C精密酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）進(jìn)行測定；NH3-N 含量 采用馮宗慈等［5］的方法測定；VFAs 含量采用秦為琳［6］的方法，利用氣相色譜（Agilent Technologies Inc. CA，美國）進(jìn)行測定，測定條件：色譜分析柱為HP-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，美國），載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度260 ℃。進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣，分流比10∶1，溶劑延遲2.5 min。程序升溫：柱溫箱的初始溫度為80 ℃，以40 ℃/min 程序升溫至120 ℃，10 ℃/min 升溫至200 ℃，后運(yùn)行至230 ℃保持3 min。

1.3.3 DNA 提取及MiSeq 測序 將凍存瘤胃液樣品在4 ℃下溶解，輕微顛倒混勻，靜置5 min，取上清液1 mL 轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管中，采用FastDNA?SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國）試劑盒和FastPrep TMFP 120 核酸提取儀，按照試劑盒說明書抽提瘤胃液中的細(xì)菌基因組DNA Nano-Drop-2000（Thermo，美國）測定DNA 濃度和純度，利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，基因組DNA 于-20 ℃保存。

用帶有barcode 的特異引物341F（CCTAYGGG RBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）來擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 序列的V3-V4 區(qū)。PCR 擴(kuò)增在20 μL 體系中進(jìn)行：4.0 μL 5×Fast Pfu 緩沖液，2.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL Fast Pfu 聚合酶；0.8 μL 正、反向引物（5 μmol/L）；10 ng 模板DNA，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。

使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，用Axy-Prep DNA Gel Extration Kit（Axygen Biosciences 公司，美國）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，取鑒定正確的PCR 產(chǎn)物上機(jī)測序。采用Illumina 的TruSeq?Nano DNA Library Prep Kit 構(gòu)建Illumina 測序文庫，最后將質(zhì)控的測序文庫用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行2×300 bp雙端測序，測序公司為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.4 生物信息學(xué)分析

測序原始數(shù)據(jù)以FASTQ 格式保存，Miseq 測序獲得的片段，經(jīng)純化、質(zhì)控，并舍棄低質(zhì)量序列（Read 尾部堿基質(zhì)量小于20，質(zhì)控后的Read 小于50 bp）后，用Usearch 7.1 軟件進(jìn)行OTU 聚類，以16S rDNA 序列97% 的相似度聚類獲得多個(gè)分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）；然后在每個(gè)OTU 的序列中選取相對豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列；將代表序列與RDP 數(shù)據(jù)庫（http：//rdp.cme.msu.edu/）進(jìn)行比對，采用RDP classifier（Ribosomal Database Program）鑒定OTU 代表性序列的微生物分類地位，并在各個(gè)分類水平（門、綱、目、科、屬、種）統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。樣本群落α - 多 樣 性 采 用Mothur 1.30.1 軟 件（http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）進(jìn)行分析。Ace 指數(shù)、Chao1 指數(shù)用于分析群落物種豐富度，Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)用于分析群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)

由表2 可知，東寶黑頭羊瘤胃液pH 為6.65，NH3-N 濃度為50.30 mg/L，總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量為43.67 mmol/L，乙酸/丙酸為4.43，乙酸比例占TVFA 最高，為67.82%。

表2 枯草期放牧東寶黑頭羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)

2.2 OTU 聚類和α-多樣性分析

經(jīng)測序，6 份瘤胃液樣品中共獲得有效序列334 920 條，經(jīng)質(zhì)量控制后共得到優(yōu)質(zhì)序列290 868條，優(yōu)質(zhì)序列長度主要分布在431～475 bp，平均序列長度為455.17 bp，序列經(jīng)拼接優(yōu)化后，由表3 可知，根據(jù)97% 的相似度水平，對所有序列進(jìn)行OTU 劃分，共獲得2 878 個(gè)，本研究平均每個(gè)樣品OUT 數(shù)為479.67，Ace 指 數(shù)為523.31，Chao1 指數(shù) 為533.79，Shannon 指數(shù)為6.39，Simpson 指數(shù)為0.96，本次測序Coverage 為0.998，表示測序范圍能涵蓋絕大部分區(qū)域。

表3 枯草期放牧東寶黑頭羊瘤胃細(xì)菌OTU 聚類和α-多樣性指數(shù)

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

基于OTU 的分類結(jié)果，對東寶黑頭羊瘤胃細(xì)菌共15 個(gè)門23 個(gè)綱29 個(gè)目34 個(gè)科87 個(gè)屬進(jìn)行鑒定，由圖1 和表4 可知，在門水平，擬桿菌門和厚壁菌門占整個(gè)瘤胃微生物的91.37%，其中擬桿菌門（Bacteroidetes，75.75%）的相對豐度最高，厚壁菌門（Firmicutes，15.62%）位居第二，而變形菌門（Proteobacteria，3.66%）、柔膜菌門（Tenericutes，2.49%）相對含量也較高；在綱水平，擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭菌綱（Clostridia）相對含量最多，分別占總菌的74.79% 和12.37%；在科水平，理研菌科（Rikenellaceae，45.89%）、普 雷 沃 氏 菌 科（Prevotellaceae，19.18%）和毛螺旋菌科（Lachnospiraceae，7.44%）為絕對的優(yōu)勢菌；在屬水平，理研菌科RC9 腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group，45.64%）、普雷沃氏菌屬1（Prevotella_1，15.46%）、普雷沃氏菌科未分類屬（Unclassified，12.65%）是瘤胃中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌，這些微生物在枯草期東寶黑頭羊瘤胃消化牧草的過程中均起著重要的作用。

圖1 瘤胃液中相對豐度較高的門、科、屬

表4 不同分類水平相對豐度較高的瘤胃細(xì)菌

3 小結(jié)與討論

本研究分析了枯草期放牧東寶黑頭羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)及瘤胃細(xì)菌多樣性。結(jié)果證明，東寶黑頭羊瘤胃細(xì)菌多樣性較低；乙酸/丙酸比值較高；最優(yōu)勢菌門為擬桿菌門，其次是厚壁菌門；理研菌科RC9腸道群是東寶黑頭羊瘤胃中最優(yōu)勢細(xì)菌屬。

瘤胃微生物數(shù)目巨大、種類繁多，擔(dān)負(fù)著多種生理功能，反芻動物通過瘤胃中微生物的發(fā)酵作用，將牧草分解為揮發(fā)性脂肪酸和氨等物質(zhì)，給動物提供能量［4］；瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)是反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)，包括pH、NH3-N 和VFAs 等主要參數(shù)，瘤胃pH 可起到穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境的作用，最適范圍為6.5～7.0［7］，過低可誘發(fā)酸中毒，過高不利于瘤胃微生物生長，本研究中東寶黑頭羊pH 為6.65，說明東寶黑頭羊瘤胃有穩(wěn)定的緩沖系統(tǒng)，發(fā)酵環(huán)境良好。NH3-N 濃度是最重要瘤胃氮代謝指標(biāo)，可反映牧草瘤胃降解率與NH3-N 利用率間的變化，其含量直接影響微生物合成菌體蛋白的數(shù)量。研究表明，瘤胃中NH3-N 適 宜 值 為63～275 mg/L［8］，本 試 驗(yàn) 瘤 胃NH3-N 為50.30 mg/L，較適宜值偏低，推測牧草種類、蛋白質(zhì)含量影響了東寶黑頭羊瘤胃微生物生長的需要；VFAs 為反芻動物最重要的能源物質(zhì)［9］，主要來源于瘤胃飼料碳水化合物的發(fā)酵，其產(chǎn)量和組成比例是評估發(fā)酵方式和能量轉(zhuǎn)化的直接指標(biāo)，VFA 主要由乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸組成，根據(jù)乙酸、丙酸、丁酸相對比例分為乙、丙、丁酸3 種瘤胃發(fā)酵類型，一般用乙酸/丙酸來表示瘤胃發(fā)酵類型的變化。在枯草期，牧草粗蛋白含量較低，纖維和結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高，在缺乏氮源的條件下，枯草期乙酸占比、乙酸/丙酸均升高，而揮發(fā)性脂肪酸含量降低［4］。研究發(fā)現(xiàn)，東寶黑頭羊是典型的乙酸型瘤胃發(fā)酵，乙酸占TVFA 的比例為67.82%。研究發(fā)現(xiàn)乙酸/丙酸值適宜范圍2.0～3.6，過高或過低都會影響瘤胃液pH 和飼糧消化率，進(jìn)而影響動物的生產(chǎn)性能［10］；Brossard 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，適宜的乙酸/丙酸可提高飼料利用率，放牧條件下，適當(dāng)提高精料飼喂量可提高丙酸的濃度，降低乙酸/丙酸值。本試驗(yàn)乙酸/丙酸值為4.43，高于適宜范圍，主要是由于枯草期放牧羊采食野生的灌木枝葉、荊棘和草本植物，而精料供給嚴(yán)重不足所致。此外研究發(fā)現(xiàn)，在放牧營養(yǎng)條件下，飼糧粗蛋白質(zhì)含量需高于12% 才能滿足微生物生長量的需要［12］，而本研究枯草期牧草粗蛋白含量僅為4.32%，這提示需在枯草期進(jìn)行補(bǔ)飼，以增加精料攝入量，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，提高其對劣質(zhì)牧草的消化率，從而滿足羊生長需要。

本研究6 個(gè)樣本共獲得優(yōu)質(zhì)序列290 868 條，OUT 數(shù)為479.67，低于川中黑山羊（947～1211）［13］；Ace 指數(shù)（523.31）低于川中黑山羊（793.03）、放牧蒙古羊（546.00），Chao1 指數(shù)（533.79）低于川中黑山羊（713.33）［14］、放 牧 蒙 古 羊（793.03）［15］，也 低 于 奶牛［16］、梅花鹿［17］、牦牛［18］等反芻動物，說明東寶黑頭羊瘤胃細(xì)菌的豐富度和多樣性相對較低。研究也發(fā)現(xiàn)，日糧成分越單一，瘤胃微生物多樣性越低［19］。由于東寶黑頭羊尚未大面積推廣，養(yǎng)殖區(qū)域較為集中，枯草期牧草種類較少，可能是東寶黑頭羊瘤胃菌群豐富度和多樣性較低的重要原因，但這些差異與研究方法、肉羊品種、飼糧等之間的關(guān)聯(lián)仍需作進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，在門水平，東寶黑頭羊瘤胃最優(yōu)勢菌門是擬桿菌門（75.75%）、厚壁菌門（15.62%），這與陳蕓等［13］闡述的川中黑山羊瘤胃細(xì)菌與曾燕等［20］闡述的蒙古羊瘤胃細(xì)菌組成相似，但相對豐度差異較大，推測可能是牧草物候期差異導(dǎo)致了本研究擬桿菌門數(shù)量大幅增加。在關(guān)于牛的研究中，放牧牦牛［4］、奶水牛［21］、錦江肉牛［22］擬桿菌門、厚壁菌門均為排名前2 位優(yōu)勢菌門，說明擬桿菌門和厚壁菌門在植物纖維降解過程中起重要作用［23］，影響著東寶黑頭羊瘤胃的消化功能。在范文斌等［15］研究中，枯草期放牧蒙古羊瘤胃中的優(yōu)勢細(xì)菌種群為厚壁菌門（58.59%）和擬桿菌門（18.18%），在董春曉等［24］研究中，湖羊瘤胃相對豐度最高的為厚壁菌門（43.32%～53.14%）、擬桿菌門（33.59%～35.39%），與本研究結(jié)果存在較大的差異，可能跟羊品種、飼養(yǎng)環(huán)境不同有關(guān)。

在屬水平，相對豐度最高的是理研菌科RC9 腸道群（45.64%），其作用是分解碳水化合物或降解蛋白質(zhì)，但這種菌屬作為第一優(yōu)勢菌群并不多見，普氏菌屬（15.46%）是第二優(yōu)勢菌屬，普雷沃菌屬幾乎可以單獨(dú)完成瘤胃內(nèi)所有飼糧成分的降解［25］。本研究結(jié)果與川中黑山羊［14］、錦江牛［22］、牦牛［4］、荷斯坦奶牛［26］等反芻動物瘤胃細(xì)菌優(yōu)勢菌屬結(jié)構(gòu)存在較大差異，具體原因尚不明晰，枯草期放牧東寶黑頭羊主要以芒、白茅、白羊草、樹枝等粗纖維含量高的植物為食，釆食條件惡劣，東寶黑頭羊在選育過程中形成了耐粗飼的特性，但這種特性是否與瘤胃微生物菌屬組成有關(guān)仍有待進(jìn)一步探索。